哮喘患儿血管紧张素转换酶基因多态性的初步研究

陈 新 周 林 钟威达

海南省妇产科医院儿科，海南 海口 570105

哮喘是一种严重危害小儿身体健康的常见呼吸道疾病，其发病率较高、病程较长且反复发作[1]。研究表明，儿童哮喘是遗传和环境因素共同作用的多基因遗传性疾病，故与哮喘的相关或易感基因的多态性越来越受到重视[2]。本研究通过检测哮喘患儿血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme，ACE）基因型及其分布，探讨ACE多态性和儿童哮喘的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2009年6月～2010年7月我院儿科收治的87例哮喘患儿为实验组，其中，男43例，女44例；年龄3～9岁，中位年龄6岁；诊断按全国儿科防治协作组制定的儿童哮喘诊断标准[3]进行。本院健康体检合格儿童58例为对照组，其中，男32例，女26例；年龄3～10岁，中位年龄6岁；对照组儿童均无哮喘病史及哮喘家族史，无食物和药物过敏史。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 ACE基因型检测方法

所有病例采集静脉血2 mL，使用Axygene全血基因组DNA抽提试剂盒（批号：QC30061104）抽提基因组DNA；ACE的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒购自大连宝生物公司，其正向引物序列为5'-CTGGAGACCACTCCCA-3'，反向引物序列为 5'-GATGTGGCCATCACATTCGCAGAT-3'，PCR 反应体系包括基因组 DNA 2 μL、10×PCR buffer 5 μL、dNTP 25 mmol/L 3 μL、Taq DNA 聚合酶0.5 μL （2.5 U），MgCl23 μL（25 mmol/L），正向引物 1 μL、反向引物 1 μL、加水至 50 μL。PCR 反应条件：94℃预变性 10 min、94℃ 45 s、58℃ 45 s、72℃ 90 s，30 个循环周期，72℃延长 10 min。取反应产物5 μL加上样缓冲液1 μL，在2%的琼脂糖凝胶电泳30 min，在紫外灯下观察结果并且摄影。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行处理，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ACE基因型结果判定

PCR产物的仅有长度为190 bp的条带，说明该产物287 bp插入片段缺失，其基因型为缺失型纯合子DD型；PCR产物仅有长度为490 bp的条带，表明该产物中存在287 bp的插入片段，其基因型为插入型纯合子II型，PCR产物有190 bp、490 bp两条条带，该产物的基因型为杂合子ID型，见图1。

图1 ACE基因型检测图例

2.2 两组ACE各基因型频率和等位基因频率比较

实验组中，38例基因型为缺失型纯合子DD型，19例基因型为杂合子ID型，30例基因型为插入型纯合子II型；在对照组中，9例基因型为缺失型纯合子DD型，18例基因型为杂合子ID型，31例基因型为插入型纯合子II型；将两组基因型进行χ2检验，结果发现实验组和对照组三种基因型的构成差异有统计学意义（χ2=12.64，P＜0.05），见表1。实验组等位基因D和I频率依次为54.59%和45.41%，对照组等位基因D和I频率依次为31.03%和68.97%，差异有统计学意义（χ2=15.60，P ＜ 0.05），见表 2。

表1 哮喘患儿ACE基因型检测结果[n（%）]

表2 哮喘患儿ACE等位基因频率[n（%）]

3 讨论

在肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）或肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）中，血浆中的肾素底物（即血管紧张素原），在肾素的作用下水解，产生一个十肽，为血管紧张素Ⅰ。血管紧张素Ⅰ本身没有生物学活性，但在肺循环血管内皮表面的ACE的作用下，血管紧张素Ⅰ水解为有活性的血管紧张素Ⅱ。研究发现，在哮喘发作时，其肾素和血管紧张素Ⅱ在血浆内的浓度明显升高[4]。血管紧张素Ⅱ在哮喘中的作用主要表现在以下2个方面[5]：首先血管紧张素Ⅱ能够导致呼吸道平滑肌收缩，引发哮喘的发作；其次，血管紧张素Ⅱ能够激活炎症因子如缓激肽、P物质等炎症因子，加快哮喘的发生和发展。

ACE基因全长21 kb，由26个外显子和25个内含子组成[6]。目前对ACE的基因多态性的研究表明，ACE第16个内含子中可以存在一段287 bp插入片段（insertion，I），也有个体缺失此片段（deletion，D），根据个体等位基因是否存在这一插入片段，ACE基因存在着DD，ID和II三种基因型[7]。研究表明，由于不同基因型，ACE的活性并不相同，DD型的ACE活性最强，ID型次之，II型最弱[8]。

笔者对ACE基因型检测结果表明，哮喘患儿缺失型纯合子（DD基因型）的比例明显高于正常儿童，哮喘患儿的D等位基因频率明显的高于正常儿童，因此推测ACE基因型为缺失型纯合子的儿童可能更加容易发生哮喘，这也提示ACE基因中是否存在插入片段可能和哮喘的发生有关。国外对成人ACE多态性和哮喘之间的研究也同样表明，ACE基因型为缺失型纯合子发生哮喘的可能性更高[4]。

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