姜黄素对博莱霉素诱导大鼠肺纤维化的保护作用

邱 慧 俞小卫 韦国桢 张德平

1.南京医科大学附属常州市第二人民医院呼吸内科，江苏 常州 213003；2.，南京大学医学院附属南京鼓楼医院呼吸内科，江苏 南京 210008

肺纤维化（pulmonary fibrosis）是大多数间质性肺疾病的最终结局，其病理特点是弥漫性肺泡炎症和肺泡上皮细胞损伤，组织修复失衡，成纤维细胞增殖，细胞外基质异常沉积，最终肺泡结构破坏和肺纤维化形成。肺纤维化发病机制尚不明确，至今无有效治疗药物。国外学者在动物肺纤维化模型的研究中证实，早期应用姜黄素可以减轻肺纤维化程度，对肺纤维化具有预防作用[1-2]。本研究利用博莱霉素建立大鼠肺纤维化模型，在大鼠肺纤维化形成阶段使用姜黄素干预，观察姜黄素对已经形成的肺纤维化的影响以及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

博莱霉素A5针剂 （天津太河制药有限公司）；姜黄素（Sigma公司，c1386）；大鼠 IL-10 酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（R&D生产，北京晶美生物技术公司分装）。

1.2 实验分组及造模方法

SPF级雄性SD大鼠 （南京大学医学院附属鼓楼医院实验动物中心）共72只，体重（180±20）g，按随机对照表法分为正常对照组（24只）、博莱霉素组（24只）和姜黄素组（24只）。正常对照组：气管内一次性注入灭菌生理盐水2 mL/kg，第15天起每日腹腔注射生理盐水0.5 mL/kg；博莱霉素组：气管内一次性注入博莱霉素A5制剂5 mg/kg，第15天起每日腹腔注射6%乙醇和6%聚乙二醇混合溶液0.5 mL/kg；姜黄素组：气管内一次性注入博莱霉素A5制剂5 mg/kg，第15天起每日腹腔注射姜黄素 （溶于6%乙醇和6%聚乙二醇混合溶液）50 mg/kg。每组分别于第 14、17、21、28 天各处死 6 只大鼠（均从腹主动脉取血5 mL后以放血法处死）。处死后，打开胸腔，结扎右肺门，行左肺肺泡灌洗术，收集支气管肺泡灌洗液（BALF）10 mL，置-70℃冰箱保存，备检 IL-10含量。

1.3 肺组织病理分析

取右肺上叶，中性甲醛固定，取石蜡包埋，梯度乙醇脱水，石蜡包埋切片，苏木精-伊红（HE）和Masson染色。由不参与实验过程的病理科医师观察病理切片。参照根据Szapiel等[3]的方法确定肺泡炎和肺纤维化程度，其分级和评分标准如下。肺泡炎分 4级，1级（0分）：无肺泡炎；2级（1分）：轻度肺泡炎，表现为单核细胞浸润、肺泡间隔增宽，病变仅限于局部和近胸膜部，受累面积小于全肺的20%；3级（2分）：中度肺泡炎，受累面积占全肺的20%～50%，近胸膜部较重；4级（3分）：重度肺泡炎，受累面积大于全肺的50%，偶见肺泡腔内出血造成实变。肺纤维化分4级，1级（0分）：无纤维化；2级（1分）：轻度纤维化，受累面积小于全肺的20%，纤维化累及胸膜及胸膜下的肺间质，肺泡结构发生紊乱；3级（2分）：中度纤维化，受累面积占全肺的20%～50%，纤维化区域从胸膜向内延伸，仍属局部性；4级（3分）：重度纤维化，受累面积大于全肺的50%，并相互融合，其间可见大小不等的囊气腔，肺泡结构严重破坏。最后累计总分。

1.4 BALF中IL-10含量测定

双抗体夹心ELISA测定BALF中IL-10含量，具体步骤参照试剂盒说明书，根据标准曲线计算。

1.5 统计学方法

使用SAS 8.1统计软件处理全部数据。计量资料以均数±标准差（）表示，比较采用单因素方差分析和SNK-q检验进行两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织病理学改变

光镜观察正常对照组未出现明显的病理变化。博莱霉素组第14天时肺间质及肺泡内有少量的淋巴细胞和巨噬细胞浸润，成纤维细胞轻度增生，肺泡间隔增宽；第17天时肺间质炎症细胞浸润更明显，肺泡壁增厚，伴轻度出血；第21天时与第17天比较无明显变化；第28天时肺泡壁明显增厚，部分肺泡腔消失，由胶原纤维、成纤维细胞及淋巴细胞占据，肺泡结构破坏，表明动物模型复制成功。姜黄素组第17天时与博莱霉素组相似，第21天和28天时肺纤维化逐渐减轻，肺间质及肺泡内有少量的淋巴细胞和巨噬细胞浸润，肺泡间隔轻度增宽，肺泡结构轻度异常。

2.2 肺泡炎评分

博莱霉素组和姜黄素组在第14、17、21、28天肺泡炎评分均高于正常对照组（均P＜0.05），但姜黄素组在第28天肺泡炎显著轻于博莱霉素组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠肺泡炎评分（，分，n=6）

表1 各组大鼠肺泡炎评分（，分，n=6）

注：与正常对照组比较，★P＜0.05；与博莱霉素组比较，△P＜0.05

组别 第14天 第17天 第21天 第28天正常对照组博莱霉素组姜黄素组0001.67±0.52★1.84±0.58★1.83±0.41★2.00±0.00★0.17±0.411.83±0.41★1.67±0.52★2.00±0.89★1.33±0.52★△

2.3 肺纤维化评分

博莱霉素组和姜黄素组在第14、17、21和28天肺纤维化评分均高于正常对照组（均P＜0.05），但姜黄素组在第21、28天时显著轻于博莱霉素组（均P＜0.05）。见表2。

2.4 BALF中IL-10含量

博莱霉素组BALF中IL-10含量在第14、17天显著高于正常对照组（均P＜0.05），但在第21、28天与正常对照组比较差异无统计学意义（均P＞0.05）。姜黄素组BALF中IL-10含量在第14、17、21、28天显著高于正常对照组 （均P＜0.05），且在第 21、28天显著高于博莱霉素组（均 P＜0.05）。见表3。

表2 各组大鼠肺纤维化评分（，分，n=6）

表2 各组大鼠肺纤维化评分（，分，n=6）

注：与正常对照组比较，★P＜0.05；与博莱霉素组比较，△P＜0.05

组别 第14天 第17天 第21天 第28天正常对照组博莱霉素组姜黄素组00001.00±0.63★1.26±0.41★1.67±0.52★1.50±0.54★1.83±0.41★1.33±0.50★△2.17±0.98★1.17±0.41★△

表3 各组大鼠支气管肺泡灌洗液中IL-10含量（，ng/L，n=6）

表3 各组大鼠支气管肺泡灌洗液中IL-10含量（，ng/L，n=6）

注：与正常对照组比较，★P＜0.05；与博莱霉素组比较，△P＜0.05

组别 第14天 第17天 第21天 第28天正常对照组博莱霉素组姜黄素组21.25±2.3526.56±3.04★25.37±2.04★22.08±2.1426.17±3.21★27.88±2.19★24.04±3.4624.06±2.5729.11±1.77★△23.19±1.5323.95±1.6232.60±2.26★△

3 讨论

姜黄素是从姜科植物姜黄的地下根茎中分离出的主要活性物质，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抑制血管新生等广泛的生物活性。姜黄素具有保护肾脏、抑制肝纤维化、帮助肌肉损伤修复、治疗白内障、抗寄生虫病等多种药理作用，且毒副作用小，使用安全，有良好的临床应用前景。高蔚等[4]研究证实姜黄素可以抑制肺纤维化大鼠成纤维细胞增殖，并诱导其凋亡，其作用呈剂量依赖和时间依赖性。张德平等[5]在大鼠肺纤维化的形成阶段使用姜黄素干预，发现姜黄素可以减轻肺泡炎和肺纤维化程度，本研究对其作用机制进行进一步研究。

IL-10是已知的免疫和炎症抑制因子，主要由淋巴细胞、巨噬细胞和肥大细胞产生，具有抑制炎症细胞浸润和致炎因子合成等生物学效应。Yamamoto等[6]在人肺纤维母细胞实验中发现IL-10可减少Ⅰ型胶原纤维和纤维连接蛋白的表达，对抗TGF-β1引起的胶原合成增多。Wilson等[7]研究报道IL-17缺乏明显降低了博莱霉素诱导的纤维化，而IL-10基因敲除小鼠可以使IL-17的主要分泌细胞Th17的反应明显增强，认为IL-10可能通过抑制促炎因子IL-23/IL-17A活性，从而阻止了博莱霉素诱导的纤维化进展。本实验研究显示，博莱霉素组和姜黄素组在肺纤维形成早期（第14、17天）BALF中IL-10含量较正常对照组明显增加，随后博莱霉素组逐渐减弱。分析其原因，可能肺纤维化发生时，体内致炎因子如TGF-β1等含量明显增加，抑制抑炎因子产生，随着病情的发展，这种抑制作用逐渐增强，最终导致炎性和抑炎性细胞因子之间失平衡，肺纤维化进一步加重。而姜黄素组IL-10含量逐渐增加，证实姜黄素可以促进抑炎因子IL-10的表达，阻止肺纤维化的进展。但也有研究结论与之相反：Barbarin等[8]研究显示，在二氧化硅所诱导的小鼠肺泡炎症及纤维化阶段，IL-10的过度表达加重了最终的肺纤维化，分析IL-10的致纤维化作用与促进Th2型细胞因子反应，增加IL-4、IL-13的表达有关。IL-10对肺纤维化的作用复杂，尚需进一步研究。

本实验研究结果显示，姜黄素通过促进IL-10表达，对已经形成的大鼠肺纤维化具有明显的保护作用，为临床使用姜黄素治疗肺纤维化提供理论依据。

[1]Punithavathi D，Venkatesan N，Babu M.Protective effects of curcumin against amiodarone-induced pulmonary fibrosis in rats[J].Br J Pharmacol，2003，139（7）：1342-1350.

[2]Venkatesan N.Pulmonary protective effects of curcumin against paraquat toxicity[J].Life Sci，2000，66（2）：PL21-28.

[3]Szapiel SV，Elson NA，Fulmer JD，et al.Bleomycin-induced interstitial pulmonary disease in the nude，athymic mouse [J].Am Rev Respir dis，1979，120（4）：893-899.

[4]高蔚，张德平，陈碧.姜黄素对肺纤维化大鼠肺成纤维细胞凋亡的诱导作用[J].中华结核和呼吸杂志，2009，32（1）：37-41.

[5]张德平，邱慧，庄谊，等.姜黄素干预对博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化的影响[J].中华结核和呼吸杂志，2007，30（3）：197-201.

[6]YamamotoT，EckesB，KriegT.Effectofinterleukin-10onthegeneexpression of typeⅠcollagen，fibronectin，and decorin in human skin fibroblasts：differential regulation by transforming growth factor-beta and monocyte chemoattractant protein-1[J].Biochem Biophys Res Commun，2001，281（1）：200-205.

[7]Wilson MS，Madala SK，Ramalingam TR，et al.Bleomycin and IL-1betamediated pulmonary fibrosis is IL-17A dependent[J].J Exp Med，2010，207（3）：535-552.

[8]Barbarin V，Xing Z，Delos M，et al.Pulmonary overexpression of IL-10 augments lung fibrosis and Th2 responses induced by silica particles[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2005，288（5）：L841-848.