乌司他丁对脓毒症急性肺损伤大鼠热休克蛋白70表达的影响

王 俏 朱 虹 沈 策▲

1.上海交通大学医学院附属第六人民医院呼吸内科，上海 200233；

2.上海交通大学医学院附属第九人民医院急诊科，上海 200011

脓毒症是一种感染引起的全身性炎症反应综合征，肺是常累及的靶器官，常并发急性肺损伤（ALI）/急性呼吸窘迫综合征（ARDS）[1]。 其中，ALI的发病急，死亡率高，是危重病治疗的难点之一。乌司他丁（Ulinastatin，UTI）是从健康成年男性尿中分离纯化的尿胰蛋白酶抑制剂[2]。研究表明，UTI除对多种蛋白酶、糖脂水解酶具有抑制作用外，还具有抑制多种炎症介质释放等作用。基础及临床初步研究提示，UTI具有减轻肺损伤，缓解呼吸衰竭等作用，但是其具体作用机制仍不明确。热休克蛋白（HSP）是一类细胞在受热、生物应激、理化因素等刺激后产生的在进化上高度保守的伴随细胞蛋白，可以增强细胞的应激能力，保护细胞损伤的发生和发展[3]。本实验旨在观察UTI对脓毒症ALI大鼠肺组织HSP70表达的影响，研究UTI对脓毒症ALI大鼠的肺保护作用，探讨可能的作用机制，为临床脓毒症肺损伤的治疗提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级雄性Wistar大鼠39只，体重200～250 g，购自中国科学院上海实验动物中心。

1.2 实验药品

乌司他丁（Ulinastatin，UTI）50000 U/支，广东天普生化医药股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 动物模型的制备与分组 39只Wistar大鼠，分为3组：假手术（sham）组 9 只，ALI组 15 只，乌司他丁（UTI）组 15只。本实验参照文献[4]的方法，以大鼠盲肠结扎穿孔术（CLP）复制脓毒症模型。以2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后固定，腹正中切开1.5 cm长的切口，在盲肠根部结扎，用18号针在游离端穿通2次，轻挤出少量肠内容物，留置2 cm皮瓣防止针孔闭合，送回盲肠于腹腔，缝合切口，术毕皮下注射生理盐水30 mL/kg抗休克。UTI组于造模前30 min腹腔注射UTI（20000 U/kg），ALI组于造模前30 min腹腔注射生理盐水2 mL。在假手术后6、12、24 h这3个时间点sham组分别处死大鼠3只，ALI组和UTI组分别处死大鼠5只。

1.3.2 标本的制备 分别于各时间点取抗凝腹主动脉血0.5 mL，行动脉血气分析，测定大鼠动脉血氧分压（PaO2），取每只大鼠左肺上叶测定肺组织湿/干重比值（W/D），取右下肺组织置于-80℃保存，用于测定肺组织中的HSP70 mRNA含量。另取左肺下叶置于10%中性甲醛溶液中固定，制成病理切片，采用苏木精-伊红（HE）染色。

1.3.3 实时荧光定量PCR（realtime-PCR）检测肺组织HSP70 mRNA含量 取肺组织50 mg，按Trizol法常规提取细胞总RNA并反转录合成cDNA，进行实时PCR扩增（Stratagene M×3000实时荧光定量PCR仪）。HSP70引物序列：上游 5′-GCA CCA GCA GCC ATC AAG AGT-3′，下游 5′-GTG TGC AAG CCG ATC ATC AGC-3′，扩增产物为 180 bp。 HSP70 实时 PCR 条件：95℃ 3 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s，共32个循环。所有待检标本每组设3个平行孔，各重复3次。标准化HSP70基因的表达量为各标本HSP70基因CT值与相应内参基因β-actin CT值的差值。

1.4 统计学方法

应用SPSS 11.0软件包分析，计量资料数据以均数±标准差（）表示，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。 以 P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动脉血气分析变化

ALI组大鼠动脉血氧分压（PaO2）随CLP术后时间的延长而降低，与sham组比较，显著降低（P<0.05），UTI组PaO2各时间点较ALI组明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 各组大鼠动脉血气分析PaO2结果比较（mm Hg，）

表1 各组大鼠动脉血气分析PaO2结果比较（mm Hg，）

注：与sham组比较，*P<0.05；与ALI组比较，#P<0.05

组别 只数 术后6 h 术后12 h 术后24 h sham组ALI组UTI组35596.3±2.0579.8±3.18*86.5±2.34*#91.5±3.2872.3±4.02*81.0±3.31*#93.7±2.4361.3±3.19*76.5±2.27*#

2.2 肺组织湿/干重比值（W/D）比值变化

ALI组大鼠W/D比值随CLP术后时间的延长而上升，较sham组显著升高（P<0.01），UTI组治疗后W/D比值明显低于ALI组同时间点，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 各组大鼠肺组织湿/干重（W/D）比值比较（）

表2 各组大鼠肺组织湿/干重（W/D）比值比较（）

注：与sham组比较，*P<0.05；与ALI组比较，#P<0.05

组别 只数 术后6 h 术后12 h 术后24 h sham组ALI组UTI组3554.037±0.0605.788±0.180*4.668±0.240*#4.138±0.2506.663±0.230*5.312±0.310*#4.241±0.4307.330±0.320*6.492±0.280*#

2.3 肺组织的病理形态学变化

sham组大鼠肺组织结构完整，肺泡腔清晰，肺间质无水肿、无炎症，且各时间点无明显差异。ALI组大鼠造模后6 h可见肺泡内水肿渗出，伴有出血及炎症细胞浸润，随时间的延长病变程度加重，至造模后24 h可见肺泡隔增宽，肺泡内严重的充血、出血及肺间质见大量炎性细胞浸润。UTI组大鼠肺组织病理变化较ALI组轻，造模后6 h可见部分肺泡内少量水肿渗出伴有少量出血，至造模后24 h可见大鼠肺泡隔略有增宽，部分肺泡内见渗出、水肿、出血，肺间质见少量炎症细胞浸润，见图1。

2.4 肺组织HSP70 mRNA的表达

ALI组大鼠肺组织HSP70 mRNA的表达水平随着CLP术后时间的延长显著升高（P<0.05），至CLP术后12 h达到高峰。UTI组大鼠各时间点肺组织HSP70 mRNA的表达水平又显著高于ALI组（P<0.05）。见表3。

表3 各组大鼠肺组织中HSP70 mRNA表达相对密度值比较（）

表3 各组大鼠肺组织中HSP70 mRNA表达相对密度值比较（）

注：与sham组比较，*P<0.05；与ALI组比较，#P<0.05

组别 只数 术后6 h 术后12 h 术后24 h sham组ALI组UTI组3550.623±0.0300.827±0.090*1.015±0.040*#0.582±0.0501.316±0.150*1.623±0.030*#0.533±0.1401.142±0.040*1.431±0.090*#

3 讨论

脓毒症常见的并发症为ALI，其病理特征是肺泡毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤，中性粒细胞在肺内聚集，表现为广泛的肺水肿和微小肺不张，临床上表现低氧血症[5]。本实验采用较经典的盲肠结扎穿孔（CLP）制作大鼠脓毒症性ALI模型。实验研究发现，ALI组大鼠动脉血氧分压（PaO2）随着时间的延长而下降明显，W/D比值随着时间的延长而增高。同时光镜下观察发现，ALI组大鼠造模后6 h可见肺泡内水肿渗出，伴有出血及炎症细胞浸润，随时间的延长病变程度加重，至造模后24 h可见肺泡隔增宽，肺泡内严重的充血、出血及肺间质见大量炎症细胞浸润。

HSP是一具有多个成员的蛋白质家族，根据分子量的大小可以分为多个亚家族，其主要功能与蛋白质代谢有关。在各种应激反应中防止蛋白质变性、聚集，对细胞具有保护作用。其中HSP70与肺脏生物学关系较为密切，是HSP中最保守的一族，在细胞应激后生成最为显著，提高机体组织对各种应激损伤的耐受性。HSP70主要是作为分子伴侣，参与蛋白质的折叠、组装和转运，清除细胞内变性的蛋白质，稳定细胞结构[6]。有研究发现，脓毒症大鼠进行呼吸机正压通气导致机械张力可诱导肺组织HSP70的表达增加，改善肺损伤[7]。将载有HSP70的腺病毒基因注入动物体内可缓解ARDS的进展[8]。HSP70可能通过多种机制防止肺损伤的发生和发展：①抗炎症，使炎症介质的产生减少，抗炎细胞因子的表达增加；②抗氧化，可抑制氧阴离子的生成，直接或间接地促进释放自身的抗氧化酶，提高抗氧化酶类的活性；③调节细胞内蛋白的修复与合成，减轻应激或损伤刺激引起的细胞膜蛋白的变性，保护细胞蛋白质rRNA及DNA的合成途径免受损伤；④抗细胞凋亡，上调细胞内Bcl-2的表达[9-10]。本实验结果显示，ALI组大鼠各时间点肺组织HSP70 mRNA表达水平较sham组显著升高，至CLP术后12 h达到高峰，后开始下降。

UTI是一种广谱的蛋白水解酶抑制剂，对多种蛋白酶、糖和脂水解酶有抑制作用，具有抑制过度的炎症反应、改善休克时组织循环与器官灌注、对溶酶体酶具有稳定作用。UTI在过度炎症反应、缺血和缺氧等造成的心、肺、肝、肾等组织细胞损害中具有保护作用。有研究表明，UTI可作用于ALI的早期环节，在转录水平通过P38MARK信号通路抑制TNF-α，改善促炎性介质/抗炎性介质失衡状态，减轻LPS诱导的ALI[11]。另外，UTI可以抑制肺泡内皮细胞表面蛋白质的分解，减小肺毛细血管的通透性[12]。临床上运用UTI治疗ALI/ARDS综合征患者，可以改善患者通气功能，减轻肺水肿，显著缓解患者的缺氧状态，减少多脏器功能衰竭的发生[13]。本实验结果显示，应用UTI治疗后，UTI组大鼠各时间点PaO2较ALI组上升，增高的W/D比值下降，HSP70 mRNA表达显著增加，同时肺组织病理形态学表现均有明显改善。提示UTI可能通过上调HSP70的表达，改善脓毒症大鼠肺组织的损伤。

综上所述，运用UTI治疗脓毒症ALI后可能通过损伤保护因子HSP70表达的上调，从而减轻了肺组织病理损伤，对ALI有保护作用。这可能是UTI治疗脓毒症ALI有效的机制之一，但其确切的机制还需要进一步深入实验研究。

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