四氧嘧啶腹腔注射致小鼠糖尿病模型因素考察

黄桂红，邓 航，李 江，付 翔，罗昱澜，邹 勇

桂林医学院附属医院药剂科，广西 桂林 541001

随着糖尿病发病率逐年增加，治疗糖尿病的药物研究随之增多。在糖尿病研究中，实验性糖尿病动物模型成功建立与否是研究成败的关键[1]。这不仅对研究糖尿病的病因和发病机制有重要意义，而且对于筛选降血糖药以及研究此类药物的作用机制有着直接的影响。因此，建立理想的糖尿病动物模型已成为人类对治疗糖尿病药物医学研究的重要课题[2]。糖尿病动物模型很多，包括化学药物（四氧嘧啶、链脲佐菌素）致糖尿病模型、催肥致糖尿病动物模型、中西医结合方法（高脂、高脂+链脲佐菌素）致糖尿病动物模型等。目前使用最多的是通过腹腔注射或静脉注射化学物质（四氧嘧啶、链脲佐菌素）两种途径获得[3]。本文就四氧嘧啶腹腔注射致小鼠糖尿病模型的影响因素及实验条件进行探讨，了解四氧嘧啶在不同条件致糖尿病模型的稳定性，以获取最佳造模实验条件，现报道如下：

1 仪器与试药

1.1 实验动物

昆明种小白鼠（SPF级），雌雄兼用。由桂林医学院实验动物中心提供，合格证号为SCXK桂2007-0001号。

1.2 仪器与试剂

紫外分光光度计（英国Biochrom，型号：libra S32PC）；高速离心机（德国 ABBOTT LABORA TORIES，型号：D-37520）；上海电子天平（上海精科天平厂，型号：FA2004）。

四氧嘧啶（美国sigma公司生产）；葡萄糖试剂盒（温州东瓯津玛生物科技有限公司，批号：200912001）；生理盐水（安徽双鹤药业有限责任公司，批号：10032030）；柠檬酸（广东汕头市西陇化工厂，批号：0511142）；柠檬酸钠（广东汕头市西陇化工厂，批号：0511142）。

1.3 统计学处理

采用统计软件SPSS 15.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（）表示，采用方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 方法与结果

2.1 溶媒对小鼠糖尿病模型制备的影响

取健康小鼠60只，雌雄各半，适应性喂养3 d后，随机分成两组，即1组和2组，每组各30只。小鼠禁食不禁水12 h，采取2%四氧嘧啶（185 mg/kg）一次性腹腔注射，其中，1组四氧嘧啶用冰生理盐水配制，2组四氧嘧啶用pH 4.5的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液配制，均避光，现用现配，冰浴保存。3 d后，禁食不禁水12 h，眼内眦取血，测空腹血糖值（fasting blood glucose，FGB），FGB 高于 11.1 mmol/L 者确定为造模成功，计算各组成模率，观察7 d，统计各组小鼠死亡情况，计算死亡率。不同溶媒对造模的影响结果显示，不同的溶媒溶解四氧嘧啶对造模有一定的影响。用缓冲液作溶媒比用生理盐水作溶媒的成模率明显增高，差异有高度统计学意义 （P＜0.01），且成模后血糖值较稳定。见表1。

表1 不同溶媒小鼠造模结果比较（，n=30）

表1 不同溶媒小鼠造模结果比较（，n=30）

注：与造模前血糖比较，*P＜0.01；与 1 组比较，aP＜0.01

1组2组组别 溶媒 造模前血糖值（mmol/L）生理盐水缓冲液5.78±2.046.07±2.46造模后血糖值（mmol/L）13.76±5.52*46.36±8.22*a成模数量（只）622a成模率（%）20.0073.33a造模死亡率（%）013.33a

2.2 造模剂量对小鼠糖尿病模型制备的影响

取健康小鼠120只，雌雄各半，适应性喂养3 d后，随机均分为6组，即对照组、1组、2组、3组、4组和5组，每组各20只。小鼠禁食不禁水12 h，其中，对照组一次性腹腔注射缓冲液，剂量为10 ml/kg，1～5组采取一次性腹腔注射2%四氧嘧啶（四氧嘧啶溶于0.1 mol/L，pH 4.5的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液现配，避光，冰浴保存），给药剂量分别为180、185、190、195、200 mg/kg。 3 d 后，禁食不禁水 12 h，眼内眦取血，测空腹血糖值，计算每组成模率，观察7 d，统计各组小鼠死亡情况，计算死亡率。不同剂量对造模的影响结果显示，当给药剂量为180 mg/kg时，小鼠死亡率较低，但与给药剂量185 mg/kg的组比较成模率低。随着四氧嘧啶注射剂量的增加，小鼠成模率降低，因为死亡率增高。结果显示，当给药剂量为185 mg/kg时，其成模率可达76.67%，且死亡率较低，可见185 mg/kg为比较合适的造模剂量。见表2。

表2 不同剂量四氧嘧啶小鼠造模结果比较（，n=20）

表2 不同剂量四氧嘧啶小鼠造模结果比较（，n=20）

注：与对照组比较，*P＜0.01；与 1 组比较，aP＜0.01，AP＜0.05；与 2 组比较，bP＜0.01，BP＜0.05；与 3 组比较，cP＜0.01，CP＜0.05；与 4 组比较，dP＜0.01，DP＜0.05；“-”表示无数据

组别 给药剂量（mg/kg）造模前血糖值（mmol/L）成模率（%）造模死亡率（%）对照组1组2组3组4组5组-1801851901952005.23±1.125.93±2.146.31±2.256.15±2.676.07±3.175.96±3.16造模后血糖值（mmol/L）7.53±3.41abcd 41.6±11.18*46.24±12.38*c 38.39±13.38*bd 48.37±5.69*c 56.78±13.91*abcD成模数量（只）010150abcd 0abcd 76453.33*Bcd 76.67*Acd 36.67*ab 33.33*ab 23.33*abC 9.12*Bcd 13.33*Acd 43.33*abd 67.67*abc 76.67*abcd

2.3 造模次数对小鼠糖尿病模型制备的影响

取健康小鼠60只，随机分为A、B、C、D 4组。适应性喂养3 d后，小鼠禁食不禁水12 h，A组在第1天一次性腹腔注射2%四氧嘧啶180 mg/kg（以生理盐水做溶媒现配，避光，冰浴保存）；B组分别在第1天及第3天各注射一次，共2次；C组分别在第1天、第3天及第6天各注射一次，共3次；D组为对照组，腹腔注射生理盐水10 ml/kg。注射完后72 h，禁食不禁水12 h，眼内眦取血，测空腹血糖值，计算每组成模率，观察7 d，统计各组小鼠死亡情况，计算死亡率。造模次数对造模的影响结果显示，在生理盐水做溶媒的条件下，造模次数增加，各组小鼠成模率比较差异无统计学意义（P＞0.05），而死亡率增大，其中C组较A组和B组死亡率均有所上升，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。小鼠死亡原因可能是多次给药，使四氧嘧啶在小鼠体内蓄积，毒性增加，造成胰岛细胞及肝肾损害加大，从而导致小鼠死亡率增高。由此可见，通过追加造模剂量不能增加小鼠的成模率，反而增大小鼠的死亡率，故利用四氧嘧啶腹腔注射造小鼠糖尿病模型最好采取一次性腹腔注射。见表3。

表3 造模次数对小鼠造模结果的比较（）

表3 造模次数对小鼠造模结果的比较（）

注：与 D 组比较，*P＜0.05；与 A 组比较 aP＜0.05；与 B 组比较，bP＜0.05

组别 数量（只）造模后血糖值（mmol/L）成模数量（只）A组B组C组D组1515151514.17±2.54*11.77±7.92*20.22±5.68*ab 5.38±2.11ab 5650成模率（%）33.33*40.00*33.33*0造模死亡率（%）013.3326.67*ab 0

2.4 性别对小鼠糖尿病模型制备的影响

取健康小鼠40只，雌雄各半，适应性喂养3 d后，随机分成两组，即雌性组和雄性组，每组各20只。小鼠禁食不禁水12 h，两组均采取一次性腹腔注射2%四氧嘧啶185 mg/kg（四氧嘧啶溶于0.1 mol/L，pH 4.5的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液中，现配，避光、冰浴保存）。3 d后，禁食不禁水12 h，眼内眦取血，测空腹血糖值，计算各组成模率，观察7 d，统计各组小鼠死亡情况，计算死亡率。小鼠性别对造模的影响结果显示，小鼠性别对造模有一定的影响。两组间小鼠成模率及死亡率差异均有统计学意义（均P＜0.05），其中雄性小鼠比雌性小鼠成模率高，且死亡率比雌性小鼠低。可能是因为雌性小鼠生理原因或由于其体质量较雄性小鼠轻，导致其对高血糖的耐受力差，死亡率增高，故选择雄性小鼠造模较合适。见表4。

表4 不同性别对小鼠造模结果比较（）

表4 不同性别对小鼠造模结果比较（）

注：与雄性组比较，*P＜0.05

组别 数量（只）雄性组雌性组造模后血糖值（mmol/L）202040.24±12.3852.57±13.98*成模数量（只）148成模率（%）70.0040.00*造模死亡率（%）10.0025.00*

2.5 体质量对小鼠糖尿病模型制备的影响

取健康小鼠40只，雄性，适应性喂养3 d后，按体质量分为两组，即18～25 g组和28～35 g组，每组各20只。小鼠禁食不禁水12 h，两组均一次性腹腔注射2%四氧嘧啶185 mg/kg（四氧嘧啶溶于0.1 mol/L，pH 4.5的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液中，现配，避光、冰浴保存）。3 d后，禁食不禁水12 h，眼内眦取血，测空腹血糖值，计算各组成模率，观察7 d，统计各组小鼠死亡情况，计算死亡率。小鼠体质量对造模条件的影响结果显示，体质量较大的小鼠成模率较体质量较轻的小鼠低，死亡率高，两组间比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。一般来说体质量较大的小鼠周龄较长，对高血糖的耐受力较差，因而死亡率较高，而体质量较轻的小鼠周龄较小，对高血糖的耐受力相对较强些，提示在实验中宜选择体质量在18～25 g的小鼠较合适。见表5。

表5 不同体质量小鼠造模结果比较（n=20）

3 讨论

四氧嘧啶（Alloxan）是一种有效的致高血糖模型的化学药物，其作用机制是利用四氧嘧啶选择性破坏胰岛β细胞，使胰岛素分泌不足而引起高血糖模型。但研究者普遍反映造模的成功率不高，存在小剂量无效、大剂量致死的现象，且四氧嘧啶致糖尿病模型的稳定性受许多因素影响，如给药剂量、溶媒、造模次数、体质量等，如不能很好地控制这些因素，就会造成动物死亡率、转阴率升高，以致模型的成功率降低，影响实验结果的可靠性[4]。

本实验选择了多种因素来探讨四氧嘧啶致糖尿病小鼠模型的影响。实验证明，四氧嘧啶由于水溶性不稳定，应现配现用，且避光保存在0～4℃环境中，在30 min内注射完，不同溶媒造模的成模率不同，其中以缓冲液做为溶媒可提高糖尿病小鼠的成模率，这可能是因为缓冲液有利于药物的溶解，减少四氧嘧啶的氧化分解，从而使进入体内的有效药量增多，另缓冲液还有助于四氧嘧啶在体内的吸收，使成模率提高。

造模剂量的大小一直是小鼠造模的关键问题，在本实验中，造模剂量为185 mg/kg时，成模率最高，死亡率较低，当造模剂量不断增高，小鼠成模后血糖也越高，造模死亡率升高，且生存质量较低，这与四氧嘧啶的毒性有关，因此剂量并非越大越好，本实验提示小鼠腹腔注射四氧嘧啶造模剂量以185 mg/kg为适宜，且造模以一次性腹腔注射较好，追加给药并不能使小鼠成模率增加，反而使小鼠死亡率增加，这与文献报道的最佳给药剂量200 mg/kg不太一致[5]。

小鼠的性别及体质量同样对造模有一定的影响。实验中发现雄性小鼠成模率高于雌性小鼠，这与文献报道的一致[6]。可能由于雌性小鼠耐受力较雄性小鼠差，因此造模后死亡率较雄性高。另外，体质量较大的小鼠较体质量轻的小鼠造模成模率低，死亡率高，可能是因为小鼠体质量大时其周龄相对较大，身体功能相对衰退，对四氧嘧啶耐受力下降，从而易导致小鼠死亡。

因此，经过筛选，本研究认为，选用雄性，体质量在18～25 g小鼠，禁食不禁水12 h，2%四氧嘧啶（用pH 4.5的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲对现配，避光、冰浴保存）以185 mg/kg造模剂量一次性腹腔注射，小鼠成模率最好，且稳定性高，值得推广应用。

[1]崔明明,王三艳,周美娥.建立四氧嘧啶糖尿病小鼠模型的研究[J].现代中西医结合杂志,2007,16(30):4431-4432.

[2]黄桂红,陈薇,罗昱澜.链脲佐菌素稳定性对诱导糖尿病小鼠模型的影响[J].华夏医学,2009,22(2):201-203.

[3]徐叔云,卞如濂,陈修.药理实验方法学[M].2版.北京:人民卫生出版社,1994:1274-1275.

[4]陈建国,梅松,付颖,等.四氧嘧啶致小鼠高血糖模型的研究[J].卫生毒理学杂志,2004,18(2):98-100.

[5]樊志奇,杨勇,容蓉,等.四氧嘧啶制备糖尿病小鼠模型的影响因素研究[J].时珍国医国药,2010,21(8):1948-1949.

[6]杨明华,杨苏蓓,柴可夫,等.四氧嘧啶致小鼠糖尿病造模条件优化及稳定性考察[J].中药药理与临床2007,23(5):213-216.