胶原酶软化CTO 中纤维瘢块的实验研究进展

强北平，Bradley Strauss

冠状动脉慢性全梗阻(CTO) 是指梗阻3 个月以上，冠状动脉造影TIMI 分级为0 或1 级的病变。CTO 病变极为常见，约占冠心病患者的30%左右［1］。临床研究表明，CTO 的成功再通治疗，能显著改善患者心绞痛症状，左室功能，减低冠心病死亡率［2］。针对CTO 的介入再通治疗，约占全部PCI (Percutaneous Coronary Intervention) 的8% ～15%，CTO 介入治疗成功与否的关键是能否将导引钢丝通过病变，达到CTO 的远端。在过去的临床及实验研究中，几乎所有的努力都集中在使用更为坚硬的导引钢丝。但由于CTO 纤维瘢块中存有大量的胶原纤维和钙化，使纤维瘢块极其坚硬，导引钢丝往往极难通过，其介入治疗成功率仅在60%左右［3］。这促使我们试图寻找一种将CTO 中纤维瘢块软化，以利于导引钢丝通过CTO 病变的方法。

胶原酶是基质金属蛋白酶 (Matrix Metalloproteinase，MMP) 的一种，其主要作用是降解基质中的胶原纤维。CTO瘢块的主要组成成分是胶原纤维，是导引钢丝通过CTO 病变的主要障碍。本实验室在过去的10 年中利用实验性CTO 动物模型发现胶原酶能降解CTO 瘢块中的胶原纤维软化纤维瘢块显著性的改善导引钢丝通过CTO 病变的成功率； 并对纯化的临床级别胶原酶进行了剂量和安全性实验研究。为了进一步了解胶原酶对心肌的影响，向猪的正常冠状动脉内注射不同剂量的胶原酶，发现在急性期(24h 内) 心肌组织有剂量依赖性的灶性出血； 低中剂量很安全，无心肌出血。胶原酶临床一期剂量和安全性研究已经完成，胶原酶治疗病例导引钢丝通过病变的成功率为75%，患者临床症状明显缓解。进一步的临床实践和国际性合作正逐步展开。

利用实验性CTO 动物模型进行了大量的实验研究，试图利用胶原酶软化纤维瘢块，促进CTO 的介入再通治疗。本文在此对这些实验研究予以综述。

1 实验性CTO 模型的病理特点

所有动物实验都经多伦多大学附属St Micheal's 医院和Sunnybrook 医院动物保护委员会同意。家兔股动脉CTO 模型制作如曾经报道过的方法［4］，将100U 牛血清凝血酶，注入两端阻断的约2cm 长的股动脉段内，静置1h 以形成稳定的血栓。然后移去结扎线，饲养动物12 ～15 周后，病变演变为慢性全梗阻用于胶原酶的应用研究。临床病理显示人冠状动脉CTO 内有大量的胶原纤维，尤其在CTO 近端，形成所谓“近端纤维帽”，此处是介入治疗时导引钢丝最难通过处，是介入再通治疗的主要障碍之一［5］。组织病理学研究表明，家兔股动脉CTO 模型经历了一个负性重塑过程。第2 周时，梗阻的血栓内形成了大量富含蛋白多糖的细胞外基质，基质成片状沉积，随后蛋白多糖含量随时间逐渐减低，胶原纤维含量则逐渐增高。胶原纤维在第2 周时尚未出现，到第6 周时其含量达10%左右； 至18 周以后其含量已达15%。纵观研究显示，CTO 近端有致密的斑块状胶原沉积［6］，这些特点与人冠状动脉CTO 极为相似(见图1) 。

2 胶原酶

胶原酶的化学名为胶原蛋白水解酶(Collagenase) ，它能在生理pH 和温度条件下特异性地切割胶原蛋白中甘氨酸残基的氨基端钛键，从而水解胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其他蛋白质和组织人体内部存在的胶原酶称为内源性胶原酶，对于体内胶原蛋白的分解起着一定的作用。药用胶原酶是从溶组织梭状芽孢杆菌的发酵液中提取、纯化并精制而得的白色或类白色无菌冻干粉针生物制剂，用于水解结缔组织中的胶原成分，其药动学特点是需要金属锌作为辅助因子参与酶解过程。胶原酶目前临床主要用于Dupuytren 氏病。Dupuytren 氏病是一种手掌内胶原纤维病理性增生的疾病，胶原纤维的进行性增生形成掌心结节和病理性键索，造成关节挛缩，严重影响手掌功能。局部注射胶原酶，可降解手掌内异常增生的胶原纤维，松解指掌关节，改善手掌功能［7－8］。胶原酶在心血管疾病的应用尚未见其他报道。

3 胶原酶软化CTO 内纤维瘢块的实验研究

3.1 实验室级别胶原酶软化CTO 内纤维瘢块，促进导引钢丝通过CTO 实验研究 实验室级别胶原酶(Collagenase Type1A，Sigma) 是从溶组织芽孢杆菌发酵而来，是包括胶原酶、非特异蛋白酶、梭菌蛋白酶、中性蛋白酶和氨基肽酶在内的多种酶的混合物。分子量在68 ～130KDa 为一般用途的胶原酶。将一直径3.0mm 的Over－the－wire (OTW) 球囊导管在X 线导引下送至髂总动脉，用2 根常规0.014 的PTCA 导引钢丝(Wizdom ［Cordis］和Choice PT ［Boston Scientific］) 分2 次试图通过CTO。如钢丝未通过CTO 且造影未发现血管撕裂，CTO 病变则被选入胶原酶应用研究。迅速将导管送至CTO 近端，将球囊打至4 个大气压，以形成1 个在球囊顶端和CTO 近端之间的封闭空间。移去钢丝，沿OTW 导管将含Type1A 原酶(100μg 或450μg) 总量为1.5ml 的液体注入此空间。最初10例，我们在 胶原酶注入1h 后立即进行导引钢丝穿过试验，均已失败告终。基于这样的经验，以后的钢丝通过试验均在胶原酶注入72h 后进行。总共45 个CTO 病变，随机行对照组(24例) 或胶原酶组(21 例) 试验。一期试验： 胶原酶100μg，n=14； 二期试验： 胶原酶450μg，n =31。当血管造影显示导引钢丝成功穿过CTO 病变，或出现较大的血管撕裂或持续25min 仍不能通过病变，则终止介入手术。然后处死动物，取出股动脉标本，做HE 和MOVAT 染色，行组织病理分析。另有6 个CTO 病变在注射胶原酶(450μg) 后24h，取出标本行胶原酶活性和胶原片段生化分析。实验结果表明，用药72h后，胶原酶治疗组导引钢丝通过CTO 病变的成功率显著高于对照组(62% VS 29%，P =0.028) ； 血管壁撕裂的发生率两组并无显著性差异。组织病理显示导引钢丝成功通过的CTO横切面内瘢块被破坏而且血液充溢开通的血管腔(见图2) 。内弹力膜撕裂的比率，胶原酶治疗组和对照组无显著性差异(15 ±17%和20 ±24%，P=0.28) 。在450μg 胶原酶治疗组可见皮肤表面轻度发绀。明胶酶谱显示有明显增多的92－和82－kDa 的裂解带，表明仅在胶原酶治疗组有MMP－9 酶前体及活性成分(见图3A) ； 蛋白免疫印记分析表明胶原降解片段也明显高于对照组(见图3B) 。本实验结果提示局部注射胶原酶，能在不破坏动脉深层结构的基础上，有效的降解CTO 内纤维瘢块的胶原成分，促进导引钢丝通过CTO 病变［4］。

3.2 临床级别胶原酶软化CTO 纤维瘢块的有效性和毒性研究 为了能将胶原酶在CTO 再通治疗中的应用推向临床，我们对一种临床级别的胶原酶的有效性和毒性进行了临床前研究。这种更为纯化的胶原酶 (CorCordase，Advance Biofactures，Lynbrook，NY) 包括两种成分，胶原酶ABC1 和胶原酶ABC2，均从溶组织芽孢杆菌分离纯化而来，都是约含1 000 个氨基酸的多肽链，前者分子量为115KD，后者为110KD［9－10］，两种成分之间无交叉免疫反应。这种纯化的胶原酶对各种胶原纤维都有一定水解活性，其强度是实验室级别胶原酶的38 倍，而且已经用于包括Dupuytren 氏病在内的临床实践。依上文所述同样方法，局部注射150μg 纯化胶原酶24h 后，导引钢丝顺利通过所有17 例CTO 病变，其中2 例出现血管撕裂。毒性研究表明，动物股部皮肤有剂量依赖性的发绀出现。注射50μg 时无发绀出现，150μg 时皮肤轻度发绀，500μg 时则有严重皮肤发绀。组织病理并未发现血管壁结构破坏。明胶酶谱显示仅胶原酶治疗组存在MMP－9 和MMP－2 酶前体及其活性成分；蛋白免疫印记分析表明胶原酶治疗组较对照组有更高的MMP－1 蛋白和胶原降解成分［11］。

3.3 冠状动脉内注射胶原酶后的安全性研究 为了进一步了解胶原酶冠状动脉内注射后的安全性，我们向正常猪的冠状动脉内注射胶原酶Type1A，以期了解胶原酶对心脏的毒性反应。在X 线引导下，将1 直径2.0 ～2.5mm 的OTW 球囊导管沿0.014 导引钢丝送至前降支第二对角支处，打开球囊至14 个大气压，冠状动脉造影以确定冠状动脉被完全阻断，然后沿OTW 导管注入(50、100、250、400、600、800、1200、1600和3200μg) 的9ml PBS 液体。8min 后除去球囊导管，行冠状动脉造影。分别于24h 或30d 后处死动物，取出心脏作病理切片，以观察心肌出血，炎症改变。冠状动脉内注射胶原酶24h后，除球囊扩张对血管壁造成的炎性反应外，未见胶原酶对血管壁的破坏作用。对照组和低剂量治疗组(600μg 以下) ，未见心肌有明显变化。高剂量组(800 ～3600μg) ，心肌则有明显的上皮出血，主要集中在右室和左室心尖。显微镜下，600～1200μg 组已出血轻度灶性出血，1600 ～3200μg 则出现中度出血。所有标本均有轻度的炎性细胞浸润。到30d 时，心肌的出血现象已消失，代之以心内膜下心肌纤维化(见图4) 。

3.4 胶原酶软化CTO 内纤维瘢块的临床研究 经过近10 年不懈的实验研究，胶原酶软化CTO 纤维瘢块的应用实践终于于2009 年从实验室走向临床。一期胶原酶剂量安全性研究已经完成。共20 例患者，所有患者均经至少1 次的PCI 血管再通治疗但均以失败告终。患者分4 组，每组5 人； 所用纯化的临床级别胶原酶剂量分别为300μg、600μg、900μg 和1200μg。胶原酶经OTW 球囊导管或fine－cross 导管送至CTO 病变处，持续约30min。24h 后，患者回到导管室，行PCI 血管再通治疗。胶原酶治疗后导引钢丝通过病变的成功率是75%。由于放支架时造成的侧支缺血，有3 例出现了非ST 段抬高的心肌梗死。3 个月后CT 血管造影显示无后续并发症，胶原酶治疗成功病例支架仍然开通； 心绞痛症状明显缓解［12］。

CTO 病变目前是介入心脏病学需要攻克的主要障碍之一，应用胶原酶软化CTO 纤维瘢块的临床研究以及多中心的国际合作正在逐步展开。也许在不远的将来胶原酶对CTO 纤维瘢块的软化，就会成为CTO、PCI 血管再通治疗的主要手段之一。

图1 人冠状动脉CTO 和家兔股动脉CTO 模型病理横切面Figure 1 Pathological transverse coronary CTO and rabbit femoral artery CTO model

图2 导引钢丝成功通过CTO 横切面的组织病理Figure 2 Tissue pathology of guide wire successfully passed the CTO transverse

图3 胶原酶治疗组与对照组的比较Figure 3 Comparison of collagenase treatment group and control group

图4 冠状动脉内注射胶原酶后的变化Figure 4 Change of intracoronary injection of collagenase

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