去甲斑蝥素对体外微管蛋白聚合的抑制作用

洪兴福，李宝赛，孙震晓

(北京中医药大学中药学院生物制药系，北京 100102)

微管存在于几乎所有真核细胞中，是构成细胞骨架的主要成分之一，由微管蛋白和微管相关蛋白构成，可以通过其亚单位的组装和去组装改变其长度或存在状态。微管在维持细胞形态、参与细胞运动、锚定细胞器位置和运输细胞内物质中起着非常重要的作用。特别是在细胞有丝分裂的过程中，当细胞由分裂间期进入分裂期后，细胞质中的微管解聚成微管蛋白，参与纺锤体的装配，介导染色体的运动;分裂进入末期后，纺锤体解聚形成游离的微管蛋白，重新参与细胞间期微管的组装。干扰微管蛋白聚合-解聚过程的药物，往往会阻滞细胞周期进程，进而引起细胞凋亡，因此，以微管为靶点的药物，一直都是研究抗癌药物的热点。

为了更好地研究微管蛋白聚合-解聚的条件以及药物对微管蛋白聚合-解聚的影响，科学家利用微管蛋白具有在37℃条件下聚合，而在0℃条件下解聚的特点，从动物的脑组织匀浆中提取微管蛋白，向微管蛋白中加入Mg2+，GTP(或ATP)和EDTA，实现了微管蛋白在离体条件下的组装与去组装，该实验体系已成为筛选和研究以微管为靶点的抗癌药物的重要手段［1-3］。

去甲斑蝥素(norcantharidin，NCTD)系斑蝥素(cantharidin)的结构同类物，与斑蝥素相比，缺少1，2位两个甲基，立体构型相同，是经人工全合成的一种新型低毒的抗癌药物，目前主要用于消化道肿瘤和肺癌的治疗［4］。我们体外实验表明NCTD具有广谱抗癌活性，特别对转移性卵巢癌细胞系SK-OV-3等有较强的生长抑制作用。NCTD能够严重干扰肿瘤细胞的有丝分裂，使纺锤体形成紊乱，引起细胞有丝分裂期阻滞，但阻滞机制不清楚［5-6］。已知一些抗癌药物如紫杉醇、秋水仙碱等主要通过影响微管蛋白的聚合-解聚过程，扰乱细胞的有丝分裂，从而发挥其抗癌作用［2-3］。本研究主要利用体外微管蛋白聚合-解聚反应体系，研究NCTD对微管蛋白的聚合-解聚过程的影响，并通过 NCTD敏感细胞系SK-OV-3进行了初步的细胞水平的验证。

1 材料与方法

1.1 化合物和试剂

NCTD购于Sigma公司，使用前用无菌双蒸水配成10 mmol·L-1的母液，-20℃保存，用前用无菌双蒸水稀释。2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、EGTA、ATPNa2、秋水仙碱、紫杉醇和考马斯亮蓝R250购于Sigma公司;丙三醇、甲醇、冰醋酸、MgCl2和 NaOH等为国产分析纯。兔抗α-微管蛋白 购自Epitomics公司;ECL试剂盒为Thermo Scientific公司产品。

1.2 微管蛋白的制备

参照文献［1，7］提取微管蛋白的方法，略有改进。将成年猪脑置于冰上，剥去脑膜和大血管，用冷的MES 缓冲液(MES 0.1 mol·L-1，EGTA 0.1 mol·L-1，ATPNa21.0 mmol·L-1，MgCl20.1 mol·L-1，用 NaOH调pH 6.5)洗2次，然后将脑组织剪碎，每克脑组织加入1 ml MES缓冲液，在4℃条件下，用电动匀浆器将其制成匀浆。

将脑组织匀浆在4℃，105000×g条件下离心1 h，取上清液，加入等体积的 MES聚合缓冲液(MES 0.1 mol·L-1，EGTA 0.1 mol·L-1，ATPNa21.0 mmol·L-1，MgCl20.1 mol· L-1，丙 三 醇8.0 mmol·L-1，用 NaOH 调 pH 6.5)，置37℃水浴保温30 min，期间轻轻振摇数次，在26℃，105000×g条件下离心1 h，弃上清，用约1/10匀浆体积的预冷MES缓冲液将沉淀物分散，置于冰浴中30 min，使沉淀物基本溶解。再重复低温和高温离心各1次，将离心得到的沉淀物，用少量预冷的 MES缓冲液在冰浴中将其溶解，得到微管蛋白溶液，置液氮中保存备用。按 Bradford法测定微管蛋白含量［8］。

1.3 微管蛋白的鉴定

常规10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，0.1%考马斯亮蓝R250染色10 min，脱色过夜。

1.4 最佳聚合微管蛋白浓度的确定

在冰浴的 96孔板中加入 5μl ATPNa240 mmol·L-1，然后加入已纯化的不同浓度微管蛋白195 μl，使其终浓度分别为 5.6，2.8，1.4 和0.7 g·L-1。在4℃于酶标仪350 nm 处迅速调零，放入37℃水浴中恒温25 min，开始时每隔1～3 min测定吸光度(absorbance，A350nm)1次，10 min后每隔5 min测1次，根据所测得的A530nm的变化绘制微管蛋白聚合曲线，确定微管蛋白聚合的合适浓度。每组设3个复孔，实验重复3次。

1.5 微管蛋白聚合和解聚动态平衡反应

参照文献［9］，在冰浴的96孔板中加入5 μl ATPNa240 mmol·L-1，然后 加 入 195 μl 浓 度 为5.74 g·L-1的微管蛋白，使其终浓度为 5.6 g·L-1。在4℃于350 nm处迅速调零，放入37℃水浴中恒温25～30 min，开始时每隔 1～3 min测定 A530nm，10 min后每隔5 min测定，根据所测得的A530nm的变化绘制微管蛋白聚合曲线。当聚合曲线进入稳定高平台期时，说明微管蛋白聚合-解聚达到动态平衡，吸光度不再发生显著的变化，聚合反应基本结束，然后，将比色皿放入4℃冰浴中25 min左右，开始时每隔1～3 min测定 A530nm，10 min后每隔5 min测定，根据所测得的A530nm的变化绘制微管蛋白解聚曲线。每组设3个复孔，实验重复3次。

1.6 Bradford法检测微管蛋白聚合-解聚活性

在上述微管蛋白聚合-解聚的反应体系中实验组加入终浓度分别为 10，20 和 30 μmol·L-1的NCTD;参照文献［9］，阳性对照组分别加入终浓度为 2 μmol·L-1的紫杉醇和 4 μmol·L-1的秋水仙碱;空白对照组加入无菌三蒸水，按照1.5中测量方法记录A530nm值的连续变化。每组设3个复孔，实验重复3次。抑制率(%)=(1-实验组A350nm/空白对照组A350nm)×100%

1.7 Western印迹法检测SK-OV-3细胞中微管蛋白蛋白含量

对数生长期的人卵巢癌SK-OV-3细胞(购自中国医学科学院肿瘤细胞库，本实验室冻存)，NCTD 60 μmol·L-1作用 8 h，分别收集对照组和药物处理组细胞，细胞计数，取相同数量的对照组和药物处理组细胞两份，细胞裂解液裂解，分别做下列实验:一份直接Western印迹法检测对照组和药物处理组SK-OV-3细胞中总微管蛋白含量［10］。另一份13000×g离心10 min，分别取上清(代表游离未聚合的微管蛋白)和沉淀(代表聚合的微管蛋白)，Western印迹法检测SK-OV-3细胞内未聚合的微管蛋白和聚合的微管蛋白的含量。Western印迹实验结果扫描后用 Quantity One(Bio-Rad公司)软件分析求半定量数据。比较加药组微管蛋白含量及对照组微管蛋白含量，计算微管蛋白含量的变化。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 微管蛋白含量测定及微管蛋白聚合-解聚体系的建立

Bradford法测定提取的微管蛋白含量为22 g·L-1，SDS-PAGE显示蛋白样品的主要组分的分子质量在55 ku左右，这与文献报道的相符，用凝胶定量分析软件Gel-Pro Analyzer Version 4.0计算微管蛋白纯度约为85%。

在4组不同浓度的微管蛋白聚合曲线(图1)中，微管蛋白浓度为5.6 g·L-1时的聚合曲线与参考文献中微管蛋白标准聚合曲线一致［7］，满足实验要求，故选取这个浓度作为以后实验浓度。

Fig.1 Polymerization of different concentration of tubulin at 37℃ from 0 to 30 min.

提取的微管蛋白在37℃水浴条件下聚合(0～25 min)，在4℃冰浴条件下解聚(25～50 min)，能够随温度的变化而发生聚合-解聚(图2)，说明本实验提取的微管蛋白具有良好的活性。

Fig.2 Polymerization of tubulin 5.6 g·L－1from 0 to 25 min at 37℃and depolymerization from 25 to 50 min at 4℃.

2.2 NCTD对微管蛋白聚合-解聚活性的影响

由图3可见，紫杉醇明显地抑制微管蛋白的解聚，且始终保持在聚合的稳定状态，而秋水仙碱在37℃水浴时，能够显著地抑制微管蛋白的聚合。

由图4可见，与空白对照相比，NCTD在0～30 μmol·L-1范围内，在 37℃ 聚合反应中，随浓度的升高抑制作用增强(P ＜0.05)，NCTD 10，20和30 μmol·L-1组对微管蛋白聚合的抑制率分别为(5.5 ±2.7)%，(7.1 ±1.2)%和(27.5 ±0.4)%，但对微管蛋白在4℃的解聚影响不显著。

Fig.3 Effect of colchicine and paclitaxel on tubulin polymerization.

Fig.4 Effect of NCTD on tubulin polymerization(37℃)and depolymerization(4℃).

2.3 NCTD对SK-OV-3细胞中微管蛋白聚合的影响

NCTD 60 μmol·L-1作用人卵巢癌 SK-OV-3 细胞8 h后，与空白对照组相比细胞中总的微管蛋白含量上升了(26.3 ±4.1)%(P ＜0.01)(图 5A);而细胞中游离的微管蛋白上升了(91.5±8.5)%(P＜0.01)(图5B);聚合微管蛋白量减少了(51.8±3.8)%(P ＜0.01)(图5C)。表明 NCTD 对细胞内微管蛋白的聚合有明显的抑制作用。

Fig.5 Effect of NCTD on tubulin polymerization in SK-OV-3 cells.NCTD 60 μmol·L-1treated cells for 8 h.A:total tubulin;B:free tubulin;C:polymeric tubulin.Lane 1:normal control group;lane 2:NCTD 60 μmol·L-1group.

3 讨论

本研究发现，NCTD对微管蛋白的聚合具有明显的抑制作用，体外条件下在一定浓度范围内(0～30 μmol·L-1)随浓度的升高抑制作用增强。由于微管蛋白参与有丝分裂过程中纺锤体的形成，介导染色体的运动，当微管蛋白的聚合作用被抑制时，药物可能会破坏纺锤体的形成，进而影响有丝分裂的进程并致使肿瘤细胞增殖受阻。但体外实验中也发现，继续增加NCTD的浓度，对微管蛋白的抑制作用并没有继续增强(结果中未显示)，是NCTD与微管蛋白的结合有饱和效应，还是高浓度的NCTD改变了微管蛋白的构象，进一步影响了微管蛋白的聚合过程，目前还不清楚。

另外，本实验的前期工作表明，NCTD在一定浓度范围可以有效地抑制SK-OV-3细胞生长和诱导细胞凋亡，本研究所用 60 μmol·L-1浓度在药物有效范围内，目前虽发现在此浓度下NCTD对细胞内微管蛋白的聚合有抑制作用，但NCTD的这种作用与细胞死亡之间的确切联系还需要进一步的实验数据来证明。

NCTD对微管蛋白的作用与秋水仙碱一样，主要抑制微管蛋白的聚合，但秋水仙碱的抑制作用远强于NCTD。有研究用14C标记的秋水仙碱类似物和内源酶消化的方法发现，秋水仙碱结合于β微管蛋白的1～36和214～241的两个残基区段［11］，NCTD 是否与微管蛋白存在特异性结合位点，是否可以采取相似的方法进行研究，还需要进一步研究。

为了进一步探讨NCTD结构与其抑制微管蛋白作用之间的相关性，我们也考察了其结构同类物斑蝥素对微管蛋白聚合-解聚的影响，结果发现，斑蝥素体外对微管蛋白的抑制作用与NCTD相似，在一定浓度范围(0～20 μmol·L-1)内具浓度依赖的正相关效应，但同样浓度抑制效应比NCTD弱(结果未显示)。NCTD与斑蝥素相比，缺少1，2位两个甲基，立体构型相同，说明斑蝥素的核心结构对微管蛋白聚合有抑制作用，而两个甲基的存在却削弱了斑蝥素与微管蛋白的结合。另外，细胞毒性实验表明，斑蝥素对细胞的毒性大于NCTD，提示斑蝥素类药物杀伤肿瘤细胞的途径不仅仅是直接抑制微管聚合一条途径。

已知斑蝥素和NCTD均为PP2A的抑制剂［12］，PP2A是一种重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，具有多种生物学活性，是染色体分离时所需要的，有实验表明，在细胞水平，斑蝥素能直接或间接与PP2A结合，引起纺锤体形成紊乱，造成有丝分裂期阻滞［6］。PP2A是否直接或间接影响微管蛋白的聚合还有待进一步研究。

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