人参总皂苷与丹参总酚酸配伍对急性血瘀大鼠血液流变性的改善作用

张 可，马 旭，2，韩淑燕，3，马治中，屠鹏飞

(1.北京大学药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室，北京 100191;2.国家知识产权局专利局专利审查协作北京中心，北京 100083;3.北京大学临床肿瘤学院北京肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室，北京 100142)

临床研究资料表明，心肌缺血患者存在不同程度的血液流变异常。冠心病在中医学中属“胸痹”范畴。中医理论认为，气为血之帅，血为气之母，气行则血行，气滞则血凝，气虚则行血无力，导致血流缓慢甚至停滞，气虚气滞均可致血瘀。因此，血液流变各项指标也是中药研究的重要观测内容，特别是在中医血瘀证的药理研究中有重要意义［1-2］。已往研究表明，人参作为传统的补气药，其单味药及制剂可防止急性心肌梗死时冠状动脉的高黏状态，预防血栓形成以及动脉硬化的发生和发展，人参Rb皂苷对急性血瘀模型大鼠血液黏度、血小板聚集和血液流变的异常变化具有明显改善作用［3］。丹参及其制剂可抑制二磷酸腺苷(ADP)和肾上腺素诱导的人或兔血小板聚集，体外给药亦可抑制大鼠血小板血栓形成时间和纤维蛋白血栓形成时间，降低全血黏度、血浆黏度和纤维蛋白原(fibrinogen，Fib)含量等［4-6］。人参总皂苷(saponins of Panax ginseng，EPG)是其发挥药效的主要活性成分，丹参总酚酸(phenolic acids of Salvia miltiorrhiza，ESM)是丹参中的主要活性成分，均具有改善血液流变异常的作用。虽然关于人参和丹参在改善血液流变方面的研究颇多，但二者的配伍研究在国内外尚未见报道。本研究以中医“气血理论”为指导，以益气药人参和活血药丹参为研究对象，观察EPG与ESM配伍对血液流变异常的改善作用。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂和仪器

EPG为本实验室自制，制备工艺为:人参饮片加60%乙醇加热回流提取4次，加醇量依次为6，4，4和4倍体积，提取时间每次均为0.5 h，合并提取液，回收乙醇后过HPD-100大孔吸附树脂，先用6倍柱体积水洗脱，继用8倍柱体积20%乙醇洗脱，再用6倍柱体积60%乙醇洗脱，收集60%乙醇洗脱液，浓缩，真空干燥，即得EPG，其中含人参皂苷Rg110.34%，人参皂苷Re 4.13%，人参皂苷Rg21.40%，人参皂苷Rb116.9%，人参皂苷 Rc 6.83%，人参皂苷 Rb24.73%，人参皂苷 Rb30.65%，人参皂苷 Rd 2.55%。

ESM为本实验室自制，制备工艺为:丹参去杂质，切成0.5 cm左右小段，加8倍体积去离子水80℃加热提取1 h，滤过，滤液备用，药渣再加6倍体积去离子水80℃加热提取2次，每次0.5 h，滤过，合并3次滤液，60℃以下减压浓缩至相对密度为1.25～1.30(50℃)，冷却至室温后加95%乙醇至含醇量达80%，静置12 h，滤过，回收乙醇，并浓缩至相对密度为1.25～1.30(50℃)，通过大孔吸附树脂AB-8(生药量与树脂比例为1∶4)，用去离子水洗至流出液无糖反应，约5倍药材量;继续用40%乙醇洗脱，从色带下来开始收集洗脱液，直至洗脱液加三氯化铁和铁氰化钾试剂不变绿并无沉淀为止，约8倍药材量，将洗脱液于60℃以下减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1.25～1.30(50℃)，喷雾干燥，即得ESM，其中含丹酚酸B 41.5%，丹参素2.32%，原儿茶醛4.74%，迷迭香酸4.53%，紫草酸1.91%。

阿司匹林肠溶片，购自拜耳医药保健有限公司，批号:BTA6E93;盐酸肾上腺素10 mg·L-1注射液，购自天津市氨基酸公司，批号:20070612;凝血酶时间(thrombin time，TT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin，APTT)、凝血酶原时间(prothrombin time，PT)和Fib含量测定试剂盒均购自北京中勤世帝科学仪器有限公司;二磷酸腺苷，购自中国科学院上海生物化学研究所。

LG-R-80B型血液黏度仪和血小板聚集凝血因子分析仪，北京中勤世帝科学仪器有限公司;TGL-16G A冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂;3F-2型多功能微量高速离心机，中国人民解放军第四军医大学航空工业部华兴航空机轮公司。

1.2 动物和急性血瘀模型的制备

Sprague-Dawley(SD)大鼠，雄性，体质量240～280 g，由北京大学医学部实验动物科学部提供，合格证号为SCXK(京)2002-0001。大鼠sc给予肾上腺素0.8 mg·kg-1共2次，间隔时间为4 h。第1次sc给予肾上腺素 0.8 mg·kg-1后 2 h，将大鼠置于0℃冰水中游泳5 min，2 h后再第2次sc给予肾上腺素 0.8 mg·kg-1，造成大鼠急性血瘀症［7］。

1.3 动物分组和给药

将大鼠随机分为6组，每组10只，即正常对照、模型、阿司匹林 100 mg·kg-1(阳性对照)、EPG 200 mg·kg-1、ESM 200 mg·kg-1和 EPG 200 mg·kg-1+ESM 200 mg·kg-1组。大鼠ig给予相应药物，正常对照和模型组大鼠ig给予等体积的空白溶剂，每天早晚各1次，共7次。于第5次给药后，除正常对照组sc给予生理盐水外，其余各组大鼠按1.2的方法造成大鼠急性血瘀症后，禁食16～18 h，期间给第6次和第7次药。最后1次给药后30 min腹主动脉取血，肝素钠20 kU·L-1抗凝血用于全血黏度、血浆黏度和血细胞比容的测定，3.8%枸橼酸钠抗凝血 (枸橼酸钠∶全血为1∶9，V/V)用于APTT，TT，PT 和 Fib及血小板聚集的测定。

1.4 全血黏度和血浆黏度的测定

以锥板式旋转黏度计测定大鼠全血黏度。取肝素抗凝的0.8 ml全血加入血液黏度计的样品池中，于37℃测定切变率200，100，50和1 s-1下的全血黏度，并计算红细胞聚集指数(erythrocyte aggregation index，EAI)，即 EAI= ηa1/ηa100，其中 ηa1是切变率 1 s-1下的全血黏度，ηa100是切变率100 s-1下的全血黏度［8］。

取2 ml肝素抗凝血，3000×g离心15 min，取0.8 ml血浆于37℃测定血浆黏度。

1.5 比浊法测定血小板聚集性

取枸橼酸钠抗凝血2 ml，800×g离心10 min，制备富血小板血浆;再以2500×g离心10 min，制备贫血小板血浆，调节血小板密度250×109L-1，以ADP终浓度5 μmol·L-1为血小板聚集诱导剂，采用比浊法于37℃测定血小板最大聚集率。

1.6 APTT，TT，PT和Fib含量的测定

取枸橼酸钠抗凝血1 ml，3000×g离心15 min，取上层血浆，采用血小板聚集凝血因子分析仪，按测定试剂盒说明的方法于37℃测定APTT，TT，PT和Fib含量。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 EPG与ESM配伍对急性血瘀大鼠全血黏度和血浆黏度的影响

表1结果显示，与正常对照组相比，模型组大鼠切变率在200，100，50和1 s-1下的全血黏度和血浆黏度明显增高(P＜0.01)。与血瘀模型组相比，单独给予 EPG 200 mg·kg-1、单独给予 ESM 200 mg·kg-1及 EPG 200 mg·kg-1与 ESM 200 mg·kg-1配伍均可显著降低全血黏度和血浆黏度 (P＜0.05，P＜0.01)，EPG与ESM配伍组与 EPG或ESM单独使用组相比无统计学差异。

Tab.1 Effect of extract of P.ginseng saponins(EPG)and S.miltiorrhiza phenolic acids(ESM)alone or in combination on whole blood and plasma viscosity in rats with blood stasis

2.2 EPG与ESM配伍对急性血瘀大鼠血小板聚集的影响

表2结果显示，与正常对照组相比，血瘀模型组大鼠的血小板聚集率明显增加 (P＜0.01)。与模型组相比，EPG 200 mg·kg-1单独使用不能显著降低血小板聚集，ESM 200 mg·kg-1单独使用以及EPG与ESM配伍均可显著降低血小板聚集 (P＜0.01)，与ESM单用相比，EPG与ESM配伍抑制血小板聚集的作用无显著性差异，而与EPG单用相比，EPG与ESM配伍组能显著降低血小板最大聚集率(P ＜0.05)。

Tab.2 Effect of EPG and ESM alone or in combination on platelet maximum rate in rats with blood stasis

2.3 EPG与ESM配伍对急性血瘀大鼠凝血参数的影响

表3结果显示，与正常对照组相比，急性血瘀模型组 Fib含量升高，APTT，TT和 PT显著缩短(P ＜0.01)。与模型组相比，EPG 200 mg·kg-1能显著降低 Fib含量，显著延长APTT，PT和TT(P＜0.05);ESM 200 mg·kg-1能显著降低 Fib 含量，显著延长APTT(P＜0.05)，但对PT和TT无明显影响。与EPG单用和ESM单用相比，EPG与ESM配伍能显著降低Fib的含量(P＜0.05)。EPG与ESM配伍组在降低Fib含量、延长APTT和TT方面与阳性对照阿司匹林相似。

Tab.3 Effect of EPG and ESM alone or in combination on fibrinogen(Fib)，activated partial thrombin time(APTT)，thrombin time(TT)and prothrombin time(PT)in rats with blood stasis

3 讨论

心肌缺血患者存在不同程度血液流变的异常，主要表现在Fib、血浆黏度、全血黏度和红细胞聚集指数升高，纤溶活性和红细胞变形下降。血液黏度的增高会引起血流阻力增强，使血流速度减慢，最后导致血流停滞，直接影响脏器血液供应，导致疾病。血液黏度主要受血浆中分子成分的影响，其中Fib是影响血浆黏度和全血黏度的主要因素之一。Fib分子为纤维状，容易弯曲，引起分子间牵连而血液黏度增大，同时Fib通过桥联作用连接邻近红细胞，使之成为可逆性缗钱簇状的一堆聚集体，导致红细胞聚集性显著增高，原来不易聚集的部位，如微动脉或毛细血管近动脉段，也可出现红细胞聚集体。当红细胞膜的弹性减低，而刚性指标增高，红细胞变硬变脆，造成组织灌注不良、缺氧和酸中毒，引起血小板聚集，这些结果又反过来加重血液黏度的增高，聚集性增高，造成恶性循环［2］。血小板是一种具有黏附、聚集和释放等多项功能的细胞。在机体止血和保护血管内皮完整性过程中起着重要作用。心肌缺血时血小板功能亢进，形成微血栓，阻塞血流，是引起组织缺血再灌注损伤加重的重要因素。APTT可反映内源性凝血系统各凝血因子总的凝血状况;PT反映外源性凝血系统因子的凝血状况。

本研究采用强迫游泳法让大鼠游泳，使大鼠处于高度应激状态，造成大鼠体力逐步衰弱，模拟中医所说的极度劳倦所致气虚证的发生过程而导致大鼠体内出现气虚血瘀，同时腹腔注射肾上腺素致大鼠心肌缺血而得到“气虚血瘀证”心肌缺血大鼠模型。研究结果表明，模型组大鼠全血黏度、血浆黏度、Fib含量和血小板聚集等均显著高于正常对照组，而APTT，TT和PT则明显低于正常对照组。EPG和ESM单独使用均可显著降低“气虚血瘀证”心肌缺血大鼠的全血黏度、血浆黏度和Fib含量，显著延长APTT，其中ESM还能显著降低血小板最大聚集率，EPG能显著延长TT和PT。EPG+ESM配伍改善血液流变多项指标的作用均优于EPG和ESM单独使用，其中在降低血小板最大聚集率方面显著优于EPG单用，在延长TT方面显著优于ESM单用，在降低Fib含量上则显著优于EPG单用和ESM单用。EPG+ESM配伍对血液流变异常的改善作用与阿司匹林相似。由此可见，EPG和ESM单用及其配伍均能改善血瘀模型大鼠血液流变的异常，但二者配伍后能进一步增强对血瘀模型大鼠血液流变异常的改善作用。

综上所述，EPG和ESM单用及其配伍均具有纠正血液流变异常的作用，且配伍组的作用优于EPG和ESM单用，进一步提示在改善血瘀大鼠的血液流变方面二者可以补气活血，气血双补，为临床上联合应用补气药和活血药进行疾病的治疗提供实验依据。

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