补体在百草枯急性中毒肺损伤中的作用研究

安莹波，王汉斌，吴小红，熊锡山，孙世惠，周育森

补体在百草枯急性中毒肺损伤中的作用研究

安莹波，王汉斌，吴小红，熊锡山，孙世惠，周育森

目的：研究补体在百草枯（PQ）急性中毒肺损伤中的作用。方法：采用20mg/kg PQ染毒小鼠，染毒后0 h、4 h、12 h、24 h、48 h检测血清C3c水平、肺组织C3、C5a和C1q沉积和分布；选用PQ染毒剂10mg/kg、20mg/kg分别在染毒前48 h、36 h、24 h腹腔内注射眼镜蛇毒因子（CVF）2.5μg/200μl，染毒后48 h留取支气管肺泡灌洗液（BALF）、肺组织，与未注射CVF以相同剂量染毒小鼠比较BALF总蛋白浓度、髓过氧化物酶（MPO）活性、组织病理以及存活率差异。结果：20mg/kg PQ染毒小鼠血清C3c水平在染毒后12 h升高，24 h达到高峰，持续至48 h；免疫组化显示染毒后4 h C3在肺组织沉积，12 h开始C3沉积减少；C5a、C1q自染毒后4 h开始在肺组织沉积，且随病程延长，着色逐渐加重；CVF阻断补体后染毒小鼠肺组织损伤减轻，炎性细胞浸润减少，且存活时间显著延长。结论：在小鼠PQ中毒急性肺损伤早期，补体即被激活，并发挥重要作用，采用CVF进行补体抑制或阻断，可以有效减轻组织病理损伤。

百草枯；急性肺损伤；补体；眼镜蛇毒因子

R 996

百草枯（paraquat，PQ）是目前使用广泛的有机杂环类除草剂，对人畜有很强的毒性，病死率高达51.7%[1]。PQ进入机体后，2 h血浆浓度达高峰，而肺内浓度是血浓度的20～90倍，易导致肺损伤，多数中毒患者死于呼吸衰竭。目前PQ中毒导致急性肺损伤机制不完全清楚，大多数学者认为与氧化还原反应所产生的毒性产物作用有关。近年来国内外研究表明，在PQ中毒导致急性肺损伤的早期，有大量细胞因子，趋化因子参与[2]。PQ中毒导致肺损伤具有急性肺损伤（ALI）典型的临床表现，其炎症反应表现为肺上皮细胞和血管内皮细胞膜受损，血管通透性增加，多形核白细胞浸润。

多种因素导致的ALI，补体即被激活，补体激活产物（如C3a,C5a）是中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核巨噬细胞在肺内聚集引起肺部炎症损伤的重要趋化因子，并与许多细胞因子与趋化因子相互作用参与组织损伤[3]。本实验通过建立小鼠PQ中毒导致急性肺损伤模型，研究血清C3c及补体成分C3、C5a和C1q在肺组织的表达。初步探讨补体在PQ中毒导致急性肺损伤中的作用，为临床干预治疗提出新的思路，以便提供有效的防治措施。

1 材料及方法

1.1 材料上海先正达投资有限公司提供20%百草枯浓缩液；碧云天生物技术研究所提供Bradford蛋白浓度测定试剂盒；南京建成生物工程研究所提供髓过氧化物酶（MPO）检测试剂盒；徐在海教授惠赠羊抗人补体C3抗体、金黄色葡萄球菌A蛋白（SPA）、过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物（PAP）；思达生物医学研究所提供大鼠抗小鼠抗补体1q抗体(C1q)；郭仁峰教授惠赠兔抗小鼠C5a多克隆抗体；北京中山生物有限公司提供生物素化兔抗大鼠IgG、生物素化山羊抗兔IgG、辣根酶标记链霉卵白素工作液、DAB显色剂。

1.2 动物实验分组BALB/c雌性小鼠，8～12周龄，清洁级，平均体重20 g，军事医学科学院动物中心提供。（1）选择40只BALB/c雌性小鼠，随机分为5组，每组8只。对照组0 h组，小鼠腹腔内注射生理盐水0.5ml。染毒组将PQ浓缩液按不同浓度以生理盐水稀释至0.5 ml后腹腔内注射，以20 mg/kg PQ进行染毒，染毒后4 h、12 h、24 h、48 h组。（2）选择72只BALB/c雌性小鼠，随机分为8组。10mg/kg染毒组2组：P10-1组8只、P10-2组10只；20mg/kg染毒组2组：P20-1组8只、P20-2组10只。动物在PQ染毒前48 h、36 h、24 h腹腔内注射眼镜蛇毒因子（CVF）溶液2.5μg/200μl。CVF+10 mg/kg染毒组2组：C10-1组8只、C10-2组10只；CVF+20mg/kg染毒组2组：C20-1组8只、C20-2组10只。其中P10-2、C10-2、P20-2、C20-2，用以观察存活率，其余小鼠染毒后48 h处死。

1.3 标本采集不同时间点给不同组小鼠腹腔内注射0.5ml氯胺酮溶液深度麻醉后，打开胸腔直接用1ml注射器经小鼠右心室取血；剪开气管，用微量移液器抽取0.8ml生理盐水，注入小鼠肺部，反复灌洗3次，回收支气管肺泡灌洗液（BALF）；留取肺组织，分别用于病理学分析、髓过氧化物酶（MPO）活性测定、免疫组化检测。

1.4 检测方法MPO、Bradford蛋白检测：严格按照MPO、Bradford蛋白浓度测定试剂盒规定对小部分肺组织及BALF实施操作。病理标本制备：部分肺组织经4%中性甲醛固定后，按梯度乙醇脱水、石蜡包埋、切片（厚度5μm），苏木素-伊红染色（HE染色），观察病理变化。C3c水平测定：小鼠右心室采血后室温放置30 min，放入4℃冰箱1 h，离心4000 g×10min，分离血清，测定C3c水平。小鼠血清C3c水平以不同时间点的测定值与正常对照之间的比值来表示。补体免疫组化检测：大部分肺组织放入盛有冷冻包埋剂（OCT）的冻存管中，经-196℃液氮速冻后，6μm冰冻连续切片，常规方法进行补体成分的免疫组化检测。取冰冻切片磷酸盐缓冲液（TBS）浸洗5min×2次；滴加一抗，37℃孵育过夜；次日取出，室温放置10min，TBS浸洗5min×3次；滴加二抗，37℃孵育30min，TBS浸洗5 min×3次；滴加PAP标记链霉卵白素工作液，37℃孵育30min，TBS浸洗5min×3次；DAB显色、苏木素衬染、乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，显微镜下观察。阳性结果为细支气管上皮基底膜、血管内皮及肺间质棕褐染色。着色程度分为强阳性（＋＋）、阳性（＋）、弱阳性（±）及阴性（－），分别以3、2、1、0表示，进行半定量分析。

1.5 统计学分析用SPSS10.0统计软件分析，计量资料以（s）表示，采用单因素方差分析。P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异非常显著。

2 结果

2.1 PQ 染毒小鼠血清C3c动态水平变化染毒后4 h血清C3c水平与正常相近；12 h升高明显，到24 h达高峰，一直持续到48 h。12 h、24 h和48 h与 0 h组之间差异非常显著（P＜0.01）。见表1。

2.2 染毒后不同时间点补体成分在肺内表达与0 h对照组（图1，A）相比，小鼠染毒后4 h补体C3在肺间质、细支气管上皮及血管内皮表达最强（图1，B），着色逐渐变淡。C5a在肺组织表达增强，染毒后24 h C5a在血管内皮着色显著（图1，C），在肺间质的表达48 h最明显。C1q在染毒后4 h肺血管内皮及间质略有沉积，12 h肺血管内皮着色显著，48 h在肺间质、细支气管上皮基底膜和肺血管内皮均有特异性着色，且最强（图1，D）。见图1。

图1 小鼠肺组织补体成分免疫组化检测（显微镜倍数×20）

2.3 补体抑制后染毒对小鼠中毒表现与存活率的情况染毒后第3天P10组部分小鼠出现皮毛疏松、活动度差，呼吸略显急促，体重下降。随病程延长，症状加重，存活率为20%；C10组小鼠无明显中毒表现，且长期存活。P20组小鼠比P10组症状明显加重，第3天P20-2组存活率为0；C20组小鼠中毒表现与P20组相似，但第3天C20组存活率为70%，第4天40%，到第5天为0。可见补体耗竭后10mg/kg染毒小鼠可长期存活，20mg/kg染毒可以延长生存时间。见图2。

表1 染毒后不同时间点各补体成分在肺内表达情况（±s）

表1 染毒后不同时间点各补体成分在肺内表达情况（±s）

注：染毒组与0 h组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

表2 补体耗竭后PQ 染毒小鼠肺系数、BALF 总蛋白含量和肺组织MPO活性（±s)

表2 补体耗竭后PQ 染毒小鼠肺系数、BALF 总蛋白含量和肺组织MPO活性（±s)

注：C10-1与P10-1组、C20-1与P20-1组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

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图2 补体耗竭后PQ 染毒对小鼠存活率的影响

2.4 补体抑制对PQ 中毒小鼠肺系数、BALF总蛋白含量和肺组织MPO 活性的情况补体耗竭后即在无补体参与情况下，C10-1与P10-1组，C20-1与P20-1组肺系数、BALF总蛋白含量和肺组织MPO活性均有所下降，组间比较，差异显著（P＜0.05，P＜0.01）。见表2。

2.5 补体抑制后染毒小鼠肺组织病理学观察染毒后48 h P10-1组小鼠肺泡上皮细胞变性脱落，肺泡腔少量渗出液，血管周围轻度组织水肿，支气管上皮细胞轻度变性，炎细胞浸润（图3，A）；而C10-1组小鼠肺损伤明显减轻，表现为肺泡上皮细胞基本完好，血管和支气管上皮细胞正常，少量炎细胞浸润（图3，B）；P20-1组小鼠肺泡上皮细胞变性脱落，肺泡腔增大，渗出较多，血管周围组织水肿，支气管上皮变性，间隔明显增宽，大量炎细胞浸润（图3，C）；C20-1组小鼠肺损伤程度较前者略轻，主要表现在肺泡内腔渗出较少，血管、支气管周围及肺间质炎细胞浸润减少，肺间隔呈局灶性增宽（图3，D）。见图3。

3 讨论

补体为机体非特异性免疫中的重要分子物质，作为机体自我保护的第一道防线，是炎症反应的主要调节机制。但补体过度激活可引起病理损伤。急性肺损伤发病早期，首先是补体系统被激活。补体活化通过经典、旁路替代和凝集素三条主要途径，都以C3活化作为枢纽。本实验采用免疫组化检测补体C3在肺组织的表达，小鼠染毒后4 h补体C3在肺间质、细支气管上皮及血管内皮表达最强，着色逐渐变淡，到48 h则低于正常小鼠。已知C3转化酶裂解C3，产生C3a和C3b，C3b半衰期很短（不到100μs），因子I裂解C3b形成iC3b和可溶性片段C3f，iC3b进一步分裂成C3dg附着于细胞膜，而释放C3c[4]。本实验检测血清C3c水平发现，染毒后4 h血清C3c水平与正常相近；到12 h升高明显，24 h达高峰，一直持续到48 h，C3c增多表明有补体的活化[5]。此结果与相关研究一致[6-7]，发现在多发性创伤和脓毒血症患者发生ALI早期表现为C3下降，C3被裂解、消耗，故裂解产物升高。C3裂解产物C3a虽然比C5a活性小10～100倍，其含量却是C5a的20倍，它可以引起血管通透性增强、刺激粒细胞脱颗粒，并可引起杯状细胞黏液分泌[8]。

图3 CVF 耗竭补体染毒小鼠肺组织HE染色（显微镜倍数×20）

PQ染毒后C1q在肺间质、细支气管上皮基底膜及肺血管内皮特异性着色逐渐增强。Mooly等[9]研究表明脂多糖诱发急性肺损伤时，C1q在发病4 h升高，到48 h开始下降。C1是补体系统经典激活途径的起始成分，C1q为具有识别作用的亚单位，在肺组织高表达，说明PQ中毒导致急性肺损伤可能有补体经典途径激活；C1q本身还可以与相应的受体结合，吞噬细胞、粒细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞等都可表达C1q-R；C1q可刺激中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等产生过氧化物，可能加重组织损伤[8]。

本实验发现，小鼠染毒后肺组织内C5a表达增强。C5a作为补体激活产物，具有广泛的生物活性，在急性肺损伤的发病中起着非常重要的作用。它是有效的髓系细胞激活剂，尤其是中性粒细胞表达很高的C5aR，趋化作用大大加强，多形核中性粒细胞在肺血管内聚集，释放氧自由基、蛋白溶解酶，导致肺毛细血管内皮细胞、肺间质及肺泡上皮细胞损伤，从而引起通透性肺水肿[10]。另外，中性粒细胞产生的氧自由基、蛋白水解酶、弹性蛋白酶、丝氨酸蛋白酶以及某些细胞因子（如IL-6）等可使C5转化为C5a，引起组织损伤。非髓系细胞如细支气管、肺上皮细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞均表达C5aR，并与C5a发生反应[11]。C5a对血管内皮的作用包括产生炎症因子（如IL-8家族和趋化因子等）和损伤产物（如组织因子有显著的凝血酶原活性），可造成血管内凝血[12]。

CVF作为旁路补体激活物，与B因子结合成CVFB复合物，在D因子作用下裂解为CVFBb复合物，类似于哺乳动物的补体转化酶C3Bb，具有裂解补体C3和C5的作用。CVFBb较C3Bb稳定，半衰期可达7 h，因此可更为持久地裂解C3、C5，直至最后耗竭[12]。本实验给小鼠连续腹腔内注射小剂量CVF后再PQ染毒，结果显示肺系数、BALF总蛋白含量、肺组织MPO活性均有所下降，后两者差异非常显著（P＜0.01）。肺组织病理观察C10、C20组小鼠肺组织损伤减轻，以C10组最为显著。小鼠在没有补体参与下染毒，肺组织中性粒细胞浸润减少，肺血管通透性减轻，损伤减轻，存活时间延长，这说明补体在PQ中毒导致急性肺损伤中可能具有促进作用，抑制补体活性可以减轻肺组织损伤。

到目前为止，PQ中毒导致急性肺损伤发病机制尚未完全阐明。长期以来，大多数学者认为氧自由基是其中毒基础，然而采取的一系列针对性治疗措施均未能使死亡率有所下降，本实验通过成功建立小鼠PQ中毒导致急性肺损伤模型，研究补体成分C3、C5a和C1q在中毒后肺组织中的表达情况，并对补体在急性肺损伤中的作用进行了初步探讨，结果发现补体在PQ中毒小鼠导致急性肺损伤早期即被激活，并可能在肺损伤中发挥重要的促进作用。然而，PQ中毒导致急性肺损伤中补体如何被激活，通过哪条途径激活及如何发挥致病作用，还需要深入研究。

[1]张锡刚，汤雪萍，李光，等.早期大剂量甲泼尼松龙联合环孢素A冲击治疗对口服百草枯中毒患者预后的影响[J].解放军医学杂志，2007，32（12）：1296-1298.

[2]Cho JH，Yang DK，Kim L，et al.Inhaled nitric oxide improves the survival of the paraquat-injured rats[J].Vascul Pharmacol，2005，42（4）：171-178.

[3]Milan Basta，Fredric Van Goor，Stefano Luccioli，et al.F（ab）2-mediated neutral ization of C3a and C5a anaphylatoxins：a novel ef fector function of immunoglobulins[J].Nature medicine，2003，9（4）：431-438.

[4]赵修竹，龚非力.补体学[M].武汉：湖北科学技术出版社，1998：16-70.

[5]李影林.中华医学检验全书[M].北京：人民卫生出版社，1997：2069-2081.

[6]Stöve S,Wel te T,Wagner TO,et al.Circulating complement proteins in patients with sepsis or systemic inf lammatory response syndrome[J]. Cl inical and Diagnostic Laboratory Immunology，1996，3（3）：175-183.

[7]Kang HJ,Bao L,Xu Y,et al.Increased serum C3 level in Cr ry t ransgenic mice par tial ly abrogates its complement inhibitory ef fects[J]. Cl in Exp Immunol，2004，136（2）：194-199.

[8]金伯泉.细胞和分子免疫学[M].北京：科学出版社，2001：240-276.

[9]Bolger MS,Ross DS,Jiang H,et al.Complement leveld and activity in the normal and LPS-injuried lung[J].Am J Physiol Lung Cel l Mol Physiol，2007，292（3）：L748-759.

[10]Whitehead GS,Grasman KA,Kimmel EC.Lung function and airway inf lammation in rats fol lowing exposure to combustion products of carbon-graphite/epoxy composite material：comparison to a rodent model of acute lung injury[J].Toxicology，2003，183（1-3）：175-197.

[11]Schmid RA，Zol linger A，Singer T，et al.Ef fect ofsoluble complement receptor type 1 on reper fusion edema and neutrophi l migration af ter lung al lot ransplantation in swine[J].J Thorac Cardiovasc Surg，1998，116（1）：90-97.

[12]Younger JG，Sasaki N，Delgado J，et al.Systemic and lung physiological changes in rats af ter int ravascular activation of complement[J].J Appl Physiol，2001，90（6）：2289-2295.

基金编号：国家自然科学基金（NSFC1071538,30972616）

100085北京，北京市海淀医院急诊科（安莹波）；解放军307医院肾内科（王汉斌，熊锡山）；军事医学科学院五所（吴小红，孙世惠，周育森）

周育森，E-mai l：yszhou@nic.bmi.ac.cn

2012-08-06）