葡萄籽原花青素减轻小鼠急性化学性肝损伤

邹金发，刘晓光，齐凤杰，叶丽平

(辽宁医学院1.病理生理学教研室;2.病理教研室;3.病理生理学教研室，辽宁锦州121001;4.辽宁省锦州市95905部队卫生队，辽宁锦州 121001)

肝性疾病目前呈逐年上升趋势，严重危害人类的健康。到目前为止，还无法彻底治愈大多数肝病。近年来有研究发现葡萄籽所含的有效成分原花青素(procyanidin)具有抗氧化和清除氧自由基的能力［1－2］。国内外研究证实葡萄籽原花青素(grape seed procyanidin，GSP)可抑制血脂，保护缺血心肌，减少动脉粥样硬化斑块的形成，对肿瘤细胞等也有不同程度的抑制作用［3－5］。但 GSP对实验性化学性肝损伤的保护作用在国内外研究不多。本实验通过复制小白鼠CCl4和酒精性肝损伤模型，探讨GSP对小鼠化学性肝损伤的影响，为保肝护肝药物的研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

动物:清洁级，雄性昆明小鼠140只，体质量18～22 g，由辽宁医学院动物实验中心提供 (合格证号:［SYXK(辽)2003-0011)］。饲养环境温度22±2℃，湿度控制在50% ～75%。

主要试剂:葡萄籽原花青素(西安天丰生物科技有限公司)，SOD、MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 实验分组及复制急性肝损伤模型

1.2.1 CCl4肝损伤模型:70只小鼠随机分为7组，每组10只，分别设对照组、CCl4肝损伤模型组、5个GSP剂量组。对照组和模型组每天灌胃相同剂量0.9%氯化钠注射液，GSP组按剂量灌胃(10、20、50、100和150 mg/kg)。7 d后除对照组外，其余各组腹腔注射0.1%CCl4花生油溶液(10 mL/kg)，17 h后检测。

1.2.2 酒精性肝损伤模型:70只小鼠随机分为7组，每组10只，分别设对照组、酒精性肝损伤模型组、5个GSP剂量组。对照组和模型组每天灌胃相同剂量0.9%氯化钠注射液，GSP剂量组处理同1.2.1。2 h后除对照组外，其他各组灌胃40%乙醇溶液 (12 mL/kg)，连续30 d。末次灌胃后禁食12 h检测。

1.3 SOD、MDA含量检测

取肝脏用冷0.9%氯化钠注射液制成10%肝组织匀浆，根据试剂盒说明检测肝组织匀浆过氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。

1.4 ALT AST含量检测

小鼠断头取血分离血清，全自动生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase，AST)含量。

1.5 HE染色观察肝脏组织形态学改变

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 GSP对CCl4肝损伤性小鼠SOD活性以及MDA、ALT和AST含量的影响

成功复制小鼠CCl4肝损伤模型。与对照组比较，模型组 SOD活性显著降低，MDA、ALT、AST含量明显升高(P＜0.01)。GSP干预组呈剂量依赖性显著缓解或减轻上述变化(P＜0.010)(表1，2)。

表1 GSP对CCl4肝损伤性小鼠肝匀浆中SOD活性及MDA含量的影响Table 1 Effect of GSP on SOD and MDA in CCl4-induced hepatic injury in mouse(±s，n=10)

表1 GSP对CCl4肝损伤性小鼠肝匀浆中SOD活性及MDA含量的影响Table 1 Effect of GSP on SOD and MDA in CCl4-induced hepatic injury in mouse(±s，n=10)

*P＜0.01 compared with control;#P＜0.05，##P＜0.01 compared with model.

group SOD(U/mgprot) MDA(nmol/mgprot)control 874±41 16.7±3.1 model 265±25* 74.3±5.1*GSP(10 mg/kg) 301±25# 53.5±4.0##GSP(20 mg/kg) 374±11## 50.4±0.5##GSP(50 mg/kg) 407±11## 41.7±4.0##GSP(100 mg/kg) 580±16## 34.9±2.9##GSP(150 mg/kg) 628±36## 33.6±3.3##

2.2 GSP对酒精性肝损伤小鼠SOD活性以及MDA、ALT和AST含量的影响

成功复制小鼠酒精性肝损伤模型。与对照组比较，模型组 SOD含量显著降低，MDA、ALT、AST含量明显升高(P＜0.01)。GSP干预组呈剂量依赖性显著缓解或减轻上述变化(P＜0.01)(表3，4)。

表2 GSP对CCl4肝损伤性小鼠血清中ALT和AST含量的影响Table 2 Effect of GSP on ALT and AST in CCl4-induced hepatic injury in mouse(±s，n=10)

表2 GSP对CCl4肝损伤性小鼠血清中ALT和AST含量的影响Table 2 Effect of GSP on ALT and AST in CCl4-induced hepatic injury in mouse(±s，n=10)

*P＜0.01 compared with control;#P＜0.01 compared with model.

group ALT(IU/L) AST(IU/L)control 49±7 145±14 model 4 009±140* 4 737±139*GSP(10 mg/kg) 2 573±75# 3 625±127#GSP(20 mg/kg) 2 082±92# 3 315±68#GSP(50 mg/kg) 9 801±28# 2 623±103#GSP(100 mg/kg) 341±16# 1 166±97#GSP(150 mg/kg) 318±6# 665±16#

表3 GSP对酒精性肝损伤小鼠肝匀浆中SOD活性及MDA含量的影响Table 3 Effect of GSP on SOD and MDA in alcohol hepatic injury in mouse(±s，n=10)

表3 GSP对酒精性肝损伤小鼠肝匀浆中SOD活性及MDA含量的影响Table 3 Effect of GSP on SOD and MDA in alcohol hepatic injury in mouse(±s，n=10)

*P＜0.01 compared with control;#P＜0.05，##P＜0.01 compared with model.

group SOD(U/mgprot) MDA(nmol/mgprot)control 874±42 16.7±31 model 225±19* 61.4±4.6*GSP(10 mg/kg) 277±14# 56.1±2.1#GSP(20 mg/kg) 295±15## 50.5±0.9##GSP(50 mg/kg) 344±12## 41.7±2.7##GSP(100 mg/kg) 406±15## 32.4±4.9##GSP(150 mg/kg) 469±16## 25.0±1.5##

表4 GSP对酒精性肝损伤小鼠肝匀浆中ALT和AST含量的影响Table 4 Effect of GSP on ALT and AST in alcohol hepatic injury in mouse(±s，n=10)

表4 GSP对酒精性肝损伤小鼠肝匀浆中ALT和AST含量的影响Table 4 Effect of GSP on ALT and AST in alcohol hepatic injury in mouse(±s，n=10)

*P＜0.01 compared with control;#P＜0.01 compared with model.

group ALT(IU/L) AST(IU/L)control 49±7 145±14 model 272±21* 590±22*GSP(10 mg/kg) 267±24 389±10#GSP(20 mg/kg) 217±40# 335±14#GSP(50 mg/kg) 154±8# 271±17#GSP(100 mg/kg) 116±8# 220±7#GSP(150 mg/kg) 83±8# 190±27#

2.3 肝脏组织的形态学改变

镜下可见对照组小鼠肝细胞形态正常，肝小叶规则，中央静脉周围肝细胞索呈放射状排列，肝细胞间及汇管区周围无炎性反应细胞浸润。CCl4肝损伤模型组肝细胞肿胀，胞质疏松化，可见明显的水样变性、点灶状坏死及桥接坏死，汇管区伴大量炎性反应细胞浸润。酒精性肝损伤模型组小叶中央区部分肝细胞发生水样变性及脂肪变性，并见少量点灶状坏死，汇管区伴大量炎性细胞浸润。与模型组比较，GSP组肝脏组织变性及坏死程度均减轻(图1)。

3 讨论

目前，对于传染性病毒性肝炎是可以通过接种疫苗进行预防，而酒精性及药物性肝损伤只能通过保肝护肝食品或者保健品来滋养防范。因此，研究者在不断地寻找天然的、安全的及有效的且物美价廉的保肝护肝产品。葡萄籽原花青素是从葡萄籽中提炼出来的，而葡萄籽是生产葡萄食品、榨汁和葡萄酒业的废弃部分，既物美价廉又很容易得到，因此对于开发保肝护肝药物有很好的前景。

图1 肝脏组织的病理变化Fig 1 Pathological change in the hepatic tissue(×400)

本研究采用两种小白鼠肝脏损伤模型来探讨GSP的保肝护肝作用。CCl4是经典的化学性肝损伤动物模型的毒剂，CCl4致毒机制为经肝微粒体细胞色素P450代谢生成自由基·CCl3攻击肝细胞膜上磷脂分子引起脂质过氧化，自由基·CCl3继而与膜脂质和蛋白质大分子进行共价结合，引起膜结构和功能完整性的破坏［6］。而机体大量摄入乙醇后，在乙醇脱氢酶的催化下大量脱氢氧化，使三羧酸循环障碍和脂肪酸氧化减弱而影响脂肪代谢，乙醇可使α-磷酸甘油增多而促进三酰甘油合成，致使脂肪在肝细胞内沉积，同时乙醇能激活氧分子产生氧自由基导致肝细胞膜的脂质过氧化及体内还原型谷胱甘肽的耗竭，同时研究证实，酒精中毒可以直接引起肝脏纤维化，并直接进入肝硬化［7］。这两种肝损伤模型均可造成实验动物血清ALT、AST的升高和肝组织匀浆中SOD下降、MDA增加以及肝组织结构的病理改变，并且重复性好。故本实验采用这两种肝损伤动物模型。MDA是氧自由基与生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的稳定代谢产物，其含量变化间接反映氧自由基含量的变化，从而反映细胞损伤的程度。SOD是一种带负电荷的金属酶，是体内重要的自由基清除剂，肝脏损伤后产生的大量自由基可以消耗SOD，使SOD水平下降，其含量变化可反映机体内源性抗氧化能力［8］。通过GSP对两种小白鼠化学性肝损伤的保护作用研究可以看出，GSP在一定剂量下，对肝脏损伤有很强的保护作用。GSP是由儿茶素和表儿茶素为单位聚合而成的多酚类化合物，具有强大的抗氧化性和清除各种氧自由基的能力，主要是通过清除氧自由基和抑制脂质过氧化来完成的［9－10］，但是否还存在其他的保护肝脏的机制还有待进一步研究。

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