Alarelin免疫绵羊对垂体GnRHR、FSHR和LHR基因表达与生殖激素分泌的作用

魏锁成，巩转娣，董江陵，谢 坤，李琼毅，韦 敏

(西北民族大学1.生命科学与工程学院;2.医学院附属医院，甘肃兰州730030;3.兰州大学基础医学院，甘肃兰州， 730000)

促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone，GnRH)在垂体前叶特异性地与垂体促性腺细胞上的受体结合，刺激促黄体素(Luteinizing hormone，LH)和促卵泡素(Follicle-stimulating hormone，FSH)的合成和分泌。然而，下丘脑合成的天然GnRH含量极低微，且不易提取与纯化，难以在临床上推广应用，目前许多学者提出可用合成的促性腺激素释放激素类似物(GnRH analogue，GnRH-A)来替代［1］。GnRH-A包括GnRH激动剂(GnRH agonist，GnRHa) 和 GnRH 拮 抗 剂(GnRH antagonist，GnRHant)。GnRH-A具有与天然的GnRH十分相似的生理和生物学作用，而且与GnRH受体(GnRHR)的结合力增强100～200倍。阿拉瑞林(Alarelin，又名丙氨瑞林)是一种GnRHa，在动物注射外源性的GnRH和GnRH-A后可提高发情期受胎率、缩短产后发情时间、提高家畜超排效果和产仔率［2］，但持续给予GnRH可以导致垂体-卵巢轴的脱敏反应，具有抑制排卵和阻断发情周期的抗生育效应［3］。动物注射GnRH-A后，对腺垂体嗜碱性颗粒细胞分泌LH和FSH的活性有无影响，脑垂体、卵巢及子宫器官的组织学结构是否发生改变等还未见报道［4］，作用机理尚不清楚［5］。有鉴于此，本研究探讨GnRHa主动免疫对激素受体的表达与生殖激素分泌的作用，为研究GnRH-A免疫调节动物机体发育和生殖功能的机理及合理应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

醋酸阿拉瑞林(Alarelin)，弗氏不完全佐剂，促性腺激素释放激素抗体试剂盒(Sigam公司);碳二亚胺盐酸盐(DC.HCL，上海源叶生物公司);Trizol，Sybr Green qPCR Master Mix(Qiagen 公司)，M-MLV Rtase，DNA聚合酶(AMERSCO公司);PCR试剂盒和RTPCR试剂盒(Invitrogen公司)。促卵泡素(FSH)检测试剂盒、促黄体激素(LH)检测试剂盒和促性腺激素释放激素(GnRH)检测试剂盒(ADL公司)。

1.2 实验动物与抗原注射

5～6月龄健康绵羊(小尾寒羊与甘肃省榆中县本地土中羊杂交的F1代)42只，体质量(24.2±2.5)kg，随机均分为 6 组(n=7)，分别标记为EG-Ⅰ、EG-Ⅱ、EG-Ⅲ、EG-Ⅳ、EG-Ⅴ和 CG(对照组)，经检验组间和组内均无显著差异。预饲15 d后进行正式实验。抗原的制备方法见参考文献［6］。EG-Ⅰ、EG-Ⅱ和EG-Ⅲ分别皮下注射阿拉瑞林抗原200、300和400 μg，0和14 d各1次;EG-Ⅳ和EG-Ⅴ皮下注射阿拉瑞林抗原200、300 μg，0、7、14 和21 d各 1 次(共 4 次);对照组皮下注射药物的溶媒，0和14 d各1次。

1.3 样本采集与处理

分别在 0、7、14、21、28、35、45、60 和70 d颈静脉采血，采血前动物禁食12 h。采集的血样立即以2 500～3 000 r/min离心 10～15 min，分离血清，－20℃保存。并于70 d颈动脉放血处死，无菌采集垂体、子宫及卵巢。采集的垂体、子宫及卵巢分为3份，第 1份 10%甲醛固定24 h，石蜡包埋、切片(5 μm)、展片、烘干、HE 染色、封固，Motic 显微镜下观察，采集图像;第2份用3%戊二醛固定，用于电子显微镜观察;第3份迅速移至预冷的Trizol中，－80℃保存，用于提取mRNA。

表1 GnRHR，FHSR和LHR mRNA引物的设计Table 1 Primers for GnRHR，FHSR and LHR mRNAs

1.4 生殖激素测定

严格按照FSH检测试剂盒、LH检测试剂盒和GnRH检测试剂盒(ELISA)的操作说明，用酶标仪分别测定不同时间的血清GnRH、FSH和LH的吸光度，并用回归方程计算浓度。

1.5 设计的引物

从GenBank中获得绵羊GnRHR基因mRNA(LOC443413)、FSHR基因 mRNA(L12767.1)和LHR基因mRNA(L36329.1)序列，用Primer Premier 5.0软件设计引物(由上海生工合成)。内参选用绵羊甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)(表1)。

1.6 腺垂体总RNA的提取

取冻存于－70℃的垂体组织，Trizol破碎，匀浆后加入0.2 mL氯仿，振荡15 s，静置3 min。4℃12 000×g，离心10 min，取上清。加入0.5 mL异丙醇，混匀，冰上静置20～30 min。4℃，12 000 r/min，10 min，弃上清。加入1 mL 75% 乙醇，洗涤沉淀。4℃，7 500×g×5 min，弃上清。室温放置晾干或超净台中吹干5 min左右，加入适量的Rnase-free H2O溶解。用1.2%琼脂糖凝胶150 V和100 mA 20 min电泳观察。

1.7 PCR扩增条件与实时荧光定量PCR(FQPCR)

用25μL体系。SybrGreen qPCR Master Mix，2X，12.5 μL;引物 F(10 μmol/L)，0.5 μL;引物 R(10 μmol/L)，0.5 μL;ddH2O，9.5 μL;Template(DNA)2 μL;总体积25 μL。每25 μL体系加2 μL DNA 模板。94℃ 5 min，95℃ 2 min，95℃ 10 s，60 ℃ 40 s，72℃ 10 min，40个循环。

GnRHR、FSHR和LHR的RNA提取和纯化后，经PCR扩增与反转录。通过对引物浓度、荧光RTPCR循环参数等进行一系列优化，确立SYBR GreenⅡ工作浓度和反应体系(25 μL)。FQ-PCR反应条件:95 ℃ 15 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，40个循环。完成上述步骤后，把加好样品的96孔板放在ABI Step one plus型荧光定量PCR仪中进行反应。以实验组 GnRHR、FSHR 和 LHR mRNA 的 2－(ΔΔCt)与对照组2－(ΔΔCt)的比值计算其相对表达量，其中 Ct表示基因扩增产物达到设定阈值所经历的循环数，ΔΔCt=实验组Ct(目的基因Ct－内参基因Ct)－对照组Ct(目的基因Ct－内参基因Ct)。

1.8 统计学分析

用Spss 18.0统计软件包处理数据，用均数±标准差(±s)表示，以 χ2检验、单因子方差分析(Tukey HSD)和多重比较进行显著性检验。

2 结果

2.1 实时荧光定量PCR相对定量结果

各实验组GnRHR mRNA、FSHR mRNA和 LHR mRNA 的 2－(ΔΔCt)均低于对照组，随着 GnRHa 注射剂量的增加，EG-Ⅰ、EG-Ⅱ和 EG-Ⅲ的 2－(ΔΔCt)值逐渐下降(表2);而且，EG-Ⅳ与 EG-Ⅰ、EG-Ⅴ和 EG-Ⅱ相比较，EG-Ⅳ和 EG-Ⅴ(注射 alarelin 4次)Gn-RHR mRNA、FSHR mRNA 和 LHR mRNA 的 2－(ΔΔCt)值分别低于EG-Ⅰ和EG-Ⅱ(注射alarelin 2次)受体mRNAs的2－(ΔΔCt)(P＜0.05)，表明加大阿拉瑞林抗原的注射剂量和增加注射次数均会抑制垂体GnRHRmRNA、FSHR mRNA和LHR mRNA的表达。

表2 GnRHR、FSHR和LHR mRNA实时荧光定量PCR结果Table 2 Values of fluorescence quantitative PCR for GnRHR、FSHR and LHR mRNAs(±s，ng/L)

表2 GnRHR、FSHR和LHR mRNA实时荧光定量PCR结果Table 2 Values of fluorescence quantitative PCR for GnRHR、FSHR and LHR mRNAs(±s，ng/L)

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001 compared with CG.

mRNA(Ct)GAPDH(Ct)group ΔΔCt 2 －(ΔΔCt)GnRHR FSHR LHR GnRHR FSHR LHR GnRHR FSHR LHR GnR HR FSHR LHR CG 26.75 33.75 30.47 24.81 24.01 24.81 0 0 0 1 1 1 EG-Ⅰ 24.65 35.80 31.08 21.93 24.81 24.01 0.78 1.25 1.41 0.58* 0.42* 0.38*EG-Ⅱ 24.91 33.90 29.9 21.67 21.12 21.12 1.30 3.04 3.12 0.41* 0.12＊＊ 0.12＊＊EG-Ⅲ 24.64 35.73 33.15 21.12 22.57 22.57 1.58 3.42 4.92 0.33＊＊ 0.09＊＊＊ 0.03＊＊＊EG-Ⅳ 26.87 34.39 29.87 24.01 21.93 21.93 0.92 2.72 2.28 0.53* 0.15＊＊ 0.21＊＊EG-Ⅴ 26.03 34.62 31.58 22.57 21.67 21.67 1.52 3.21 4.25 0.35＊＊ 0.11＊＊ 0.05＊＊＊

2.2 血清GnRH浓度

对照组血清GnRH含量保持稳定，免疫后45 d之内，实验组血清GnRH浓度持续下降，EG-Ⅰ和EG-Ⅱ在 21 和28 d达到谷值(P＜0.05)，EG-Ⅲ、EG-Ⅳ和EG-Ⅴ则在45 d达到谷值(P＜0.01)，且以EG-Ⅴ为最低。谷值之后逐渐上升趋势，70 d时达到免疫注射前水平。表明GnRHa主动免疫对母羊GnRH的分泌有抑制作用，而且随着注射剂量和注射次数的增加，这种作用更加明显(图1)。

图1 血清GnRH浓度Fig 1 Serum concentrations of GnRH(±s，ng/L)

2.3 血清FSH浓度

从14 d开始实验组的血清FSH浓度也逐渐升高，EG-Ⅰ(P＜ 0.05)、EG-Ⅱ(P＜ 0.01)和 EG-Ⅲ(P＜0.01)分别28、35和35 d达到峰值，而 EG-IV和EG-V在45和60 d达到高峰值(P＜0.01)。整个实验期间实验组始终高于对照组(P＜0.05)，尤其是EG-V效果更显著(图2)。表明多次注射GnRHa可以增强FSH的合成与分泌，而且注射剂量大作用更明显。对照组血清FSH浓度呈轻度增加趋势。

图2 母绵羊血清FSH测定值Fig 2 The concentration of serum follicle stimulating hormone in ewes(±s，ng/L)

2.4 血清LH浓度

对照组血清LH含量保持基本恒定，实验组绵羊血清 LH 呈下降趋势，EG-Ⅰ(P＜0.01)、EG-Ⅱ(P＜0.05)和 EG-Ⅲ(P＜0.05)分别在 21、21 和28 d达到谷值(P＜0.05)，EG-Ⅳ和 EG-Ⅴ在35 d达到谷值(P＜0.01)。然后逐渐升高，至70 d时恢复到注射前水平。35 d时EG-Ⅳ和EG-Ⅴ低于EG-Ⅰ、EG-Ⅱ和EG-Ⅲ(图3)。表明GnRHa抗原免疫对垂体分泌与释放LH有抑制作用，而且随着注射剂量和注射次数的增加，这种作用更加明显。

2.5 血清E2浓度

整个实验期间实验组和对照组血清E2含量无明显变化，各组间无显著差异。

图3 绵羊血清LH测定值Fig 3 The concentration of serum luteinizing hormone in ewes(±s，IU/L)

3 讨论

GnRHa对体外培养的卵巢细胞分泌固醇类激素具有抑制作用，GnRHa能穿透卵泡膜进入卵泡液，影响颗粒细胞的功能及卵子的成熟［7］。应用GnRH-A可抑制垂体GnRHR，LHR和FSHR mRNA的表达［8－9］。然而，对GnRHa免疫注射后激素受体mRNA的表达和分布是否发生改变迄今未见研究报道，其机理尚不清楚［10］。GnRH抗体与GnRHR结合，使垂体中 GnRHR明显减少，影响了内源性GnRH与GnRHR的结合，改变了激素的作用。本实验证明绵羊腺垂体中有丰富的RNA，GnRHa主动免疫绵羊后，实验组GnRHR、FSHR和LHR mRNA值均低于对照组，EG-Ⅳ和EG-Ⅴ的mRNA值低于EG-Ⅰ和EG-Ⅱ。由于GnRH免疫减少了垂体GnRH的表达水平，可以引起性腺激素含量及生殖行为的改变［12］。用GnRH免疫公羊和母羊后，外周血液中LH和FSH水平与对照组相比明显降低［11］。本实验证实，Alarelin主动免疫母羊后，血清GnRH和LH浓度初期逐渐降低到谷值，而后逐渐上升。实验期间，实验组血清FSH始终高于对照组，而E2浓度无显著差异。雌激素由卵巢中卵泡的颗粒细胞和膜细胞合成，不同的卵泡阶段雌激素的分泌量不同。在女性月经周期中，血液中雌激素的水平发生周期性变化。卵泡期开始时，血中雌激素浓度较低，对FSH和LH的反馈抑制较弱。在排卵前1周左右，血中雌激素浓度明显上升，至排卵前1天左右雌激素浓度达到顶峰，下丘脑增加GnRH的分泌，并刺激FSH与 LH 的分泌［1，13］。然而，这种现象在母绵羊中是否同样出现，与羊的品种及发情周期等有关尚需深入研究。本实验结果与使用甾体激素、第三脑室灌注 GnRH［14］以及在家兔的相关研究结果相似［6，15］。

总之，阿拉瑞林主动免疫可抑制垂体GnRHR mRNA、FSHR mRNA和LHR mRNA的表达，促进垂体合成与释放FSH，增加血清FSH含量，降低GnRH和LH浓度。增加阿拉瑞林抗原的免疫剂量和注射次数，作用更加明显。本研究为合理应用GnRH类似物调节生殖功能和治疗卵巢及子宫疾病提供了科学依据。

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