高果糖饮食对大鼠肾脏的毒性作用

胡志娟，刘 冰，李 凡，孙 文，宋光耀*

(河北省人民医院1.肾内科;2.内分泌科，河北石家庄 050051)

肾脏疾病中常伴有各种类型的脂质代谢异常，且一直被认为是肾病造成的。1982年，Moorhead和同事提出脂质肾毒性学说，认为在一些情况下，循环中的脂质可能直接损害肾小球结构，高脂血症在启动肾小球损害到肾小球硬化的过程中是一个重要的加重因素［1］。当今饮食结构的变化致使果糖的摄入量逐年增加。人体及动物实验研究表明，果糖代谢所导致的三酰甘油的甘油和酰基部分明显增多，从而使脂质从头合成以及三酰甘油合成的速率明显增强［2］。果糖同葡萄糖相比，更能诱导固醇反应元件结合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c)和肝脏脂质从头合成［3］。本研究采用高果糖饮食喂养诱导大鼠高三酰甘油血症，观察肾组织脂质的蓄积及肾脏病理形态的变化，探讨脂质肾毒性的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物模型的建立与分组

清洁级雄性Wiatar大鼠32只，体质量200 g左右，(河北医科大学动物室提供，合格证号1003188)，随机均分成正常对照组(N组)和高果糖组(F组)。正常对照组喂饲普通饲料，高果糖组中果糖占热量的34.5%。每日记大鼠进食量，每周记大鼠体质量。喂养8、16周时各处死大鼠8只，大鼠处死前1 d采用代谢笼收集24 h尿标本，处死时留取血标本。肾脏经0.9%氯化钠注射液充分灌洗后称重，部分组织以10%甲醛固定、石蜡包埋，制成3 μm厚切片，其余组织液氮保存备用。

1.2 生化测定

腹腔注射3%戊巴比妥麻醉各组大鼠(2 mL/100 g)，右侧颈动脉取血标本约8 mL。血肌酐、尿素氮、空腹血糖及血脂的测定在Beckman全自动生化分析仪上完成。24 h尿微量白蛋白定量采用免疫比浊法。

1.3 肾皮质脂质提取及三酰甘油测定

用0.1 mmol PBS缓冲液进行左肾灌洗，灌洗速度为10 mL/min，PBS总量为50 mL，灌洗后肾脏呈灰白色，分离肾皮质，取200 mg皮质按 Macala等［4］方法进行脂质提取及定量分析。

1.4 肾组织病理检测

经10%甲醛固定的肾组织石蜡包埋，制成3 μm厚的切片，常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化行PAS染色。

1.5 免疫组织化学法检测Ⅳ型胶原(Ⅳ-type collagen)、α-平滑肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表达

肾组织进行3 μm厚的连续切片。二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，0.4%胃蛋白酶37℃孵育30 min(Ⅳ型胶原)，3%H2O2室温孵育10 min灭活内源性过氧化物酶，PBS冲洗2 min×3次;分别滴加兔抗Ⅳ型胶原抗体及兔抗α-SMA(武汉博士德公司)4℃过夜，PBS冲洗2 min×3次;再依次加入聚合物辅助剂和辣根酶标记的1∶100兔抗IgG工作液，37℃孵育20 min，每步后均PBS冲洗，2 min×3次。DAB(二氨基联苯胺)显色，苏木素复染，常规脱水、透明、封片镜检。PBS(磷酸盐)缓冲液替代一抗作阴性对照。免疫组化照片经灰度扫描测定吸光度值 (A value)。

1.6 电镜检查

常规4%戊二醛固定肾组织、切片，电镜下观察大鼠肾小球基底膜。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 左肾质量/体质量、肾功能、血脂、空腹血糖及24 h尿微量白蛋白

三酰甘油、极低密度脂蛋白及24 h尿微量白蛋白在高果糖组明显升高(P＜0.05)，且随时间延长其水平均增加(表1)。

2.2 肾皮质三酰甘油含量

与对照组比较，高果糖组肾皮质三酰甘油含量明显增加(P＜0.05)，且随时间延长其水平均增加(表2)。

2.3 肾脏病理改变

高果糖组大鼠肾小球系膜细胞及基质弥漫增生，肾小管上皮空泡及颗粒变性，随时间延长，病变加重，肾间质及小血管未见明显病变(图1)。

2.4 肾组织Ⅳ型胶原、α-SMA的表达

与对照组比较，高果糖组大鼠Ⅳ型胶原在肾小球基底膜、系膜区的表达显著升高(P＜0.01)，随病程延长，表达增强。α-SMA仅在正常大鼠血管平滑肌细胞中表达;高果糖组大鼠肾小管上皮细胞、肾间质细胞可见阳性表达(P＜0.01)(表2，图2，3)。

表1 各组大鼠左肾质量/体质量、肾功能、血脂、空腹血糖及24 h尿微量白蛋白Table 1 Left kidney weight/body weight，BUN，Scr，blood lipid，FPG and urinary microalbumin of 24 hours in two groups by the end of 8 and 16 weeks(±s，n=8)

表1 各组大鼠左肾质量/体质量、肾功能、血脂、空腹血糖及24 h尿微量白蛋白Table 1 Left kidney weight/body weight，BUN，Scr，blood lipid，FPG and urinary microalbumin of 24 hours in two groups by the end of 8 and 16 weeks(±s，n=8)

＊P＜0.05 compared with N group.

group time(weeks)KW/BW(×10－3)BUN(mmol/L)Scr(μmol/L)TC(mmol/L)TG(mmol/L)VLDL(mmol/L)FPG(mmol/L)24 hUMA(μg)N 8 3.11±0.27 6.46±0.50 33.75±3.28 1.50±0.210.79±0.31 0.40±0.14 5.19±0.58 20.00±6.00 16 3.34±0.56 6.59±1.37 41.39±6.39 1.66±0.14 1.09±0.36 0.50±0.16 5.45±0.47 45.00±24.00 F 8 3.38±0.22 6.54±0.66 42.56±8.25 1.59±0.20 1.65±0.86* 0.75±0.39* 5.84±0.56 63.00±12.00*16 3.63±0.41 6.69±0.85 45.57±3.67 1.82±0.65 2.13±0.87* 0.97±0.40* 6.01±0.37 150.00±48.00*

图1 各组大鼠肾组织PAS染色Fig 1 PAS staining in two groups by the end of 8 and 16 weeks(×200)

表2 各组大鼠肾皮质三酰甘油含量及肾组织Ⅳ型胶原、α-SMA的表达Table 2 Triglyceride of renal cortices，obsorbance ratio(A value)of Ⅳ-type collagen and α-SMA in two groups by the end of 8 and 16 weeks(±s，n=8)

表2 各组大鼠肾皮质三酰甘油含量及肾组织Ⅳ型胶原、α-SMA的表达Table 2 Triglyceride of renal cortices，obsorbance ratio(A value)of Ⅳ-type collagen and α-SMA in two groups by the end of 8 and 16 weeks(±s，n=8)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 compared with N group;#P＜0.05 compared with 8 weeks.

group time(weeks) TG of renal cortices(mg/g) Ⅳ-type collagen α-SMA N 8 4.30±0.76 0.316±0.017 0.109±0.011 16 5.16±1.70 0.325±0.015 0.115±0.012 F 8 7.21±2.20* 0.405±0.016＊＊ 0.218±0.013＊＊16 7.92±3.05* 0.427±0.017＊＊# 0.240±0.014＊＊#

图4 各电镜观察各组大鼠肾小球基底膜Fig 4 Electron microscope for GBM in two groups by the end of 8 and 16 weeks(×20 000)

2.5 电镜观察肾小球基底膜

电镜下，对照组大鼠肾小球基底膜内疏松层、致密层、外疏松层结构清晰，厚度均匀，可见内皮细胞窗孔及足细胞突起。高果糖组肾小球基底膜弥漫增厚足细胞突起融合，内皮细胞吞噬脂质，随病程延长，病变加重，未见电子致密物(图4)。

3 讨论

高果糖饮食主要导致两方面的代谢影响:对葡萄糖的摄取和代谢的扰乱，以及脂质从头合成和三酰甘油合成速率的明显增强。果糖对机体的危害有:肥胖、加速衰老、胰岛素抵抗、糖尿病、糖尿病并发症(视网膜病变、肾脏疾病、神经疾病)、非酒精性脂肪肝、高三酰甘油血症、高尿酸血症、慢性腹泻、肠应激综合征、荨麻疹［5］。随着我国人民生活水平的提高和饮食结构的改变，高三酰甘油血症的患病人数逐年增多，临床上高三酰甘油血症可导致脂、蛋白、糖代谢异常的相关报道已屡见不鲜［6］。

本研究中，经过8周高果糖饮食诱导大鼠高三酰甘油血症及高极低密度脂蛋白血症，而血糖水平无明显升高;16周时，大鼠的上述指标升高更为明显而血糖水平仍无显著差异，提示脂代谢紊乱往往出现在糖代谢紊乱之前。因此，脂代谢异常是糖代谢紊乱的驱动因素之一。

肾脏疾病时常常伴有高三酰甘油血症，研究发现血清三酰甘油水平与尿蛋白排泄率、肾小球滤过率的下降具有显著相关性［7］，提示三酰甘油以及富含三酰甘油的脂蛋白具有肾毒性作用［8－9］。

本研究发现，高果糖饮食诱导大鼠不仅发生高三酰甘油血症及高极低密度脂蛋白血症，在肾皮质亦出现三酰甘油的蓄积，表现在肾皮质三酰甘油含量增加，随时间延长，上述指标水平升高。高果糖组大鼠在实验8周时出现尿微量白蛋白水平显著增加，该指标是早期肾损害较为敏感的指标，提示肾脏损伤。PAS染色可见高果糖组大鼠肾小球系膜细胞及基质弥漫增生，肾小管上皮空泡及颗粒变性，随时间延长，病变加重，肾间质及小血管未见明显病变。免疫组织化学也表明，肾小球硬化的指标-存在正常大鼠肾小球基底膜和系膜区的Ⅳ型胶原，在高果糖组表达增强;肾小管间质纤维化的指标仅在正常大鼠血管平滑肌细胞中表达的α-SMA，在高果糖组大鼠肾小管上皮细胞、肾间质表达，提示肾脏病变的进展。电镜下，不仅可见肾小球基底膜增厚，足细胞突起融合，尚可见内皮细胞吞噬脂滴。表明肾脏的固有细胞均参与了肾脏疾病的发生发展。高三酰甘油血症造成的肾损害为非免疫复合物介导，故电镜下未见到电子致密物。

当然，肾脏固有细胞摄取富含三酰甘油的脂质后，转化为泡沫细胞，后者连同固有细胞本身可以分泌许多炎性反应介质，如生长因子、白介素等造成肾小球系膜细胞增殖、细胞外基质积聚、肾小球硬化［10］。

综上所述，高三酰甘油血症可造成Wistar大鼠尿微量白蛋白水平增加、肾脏脂质积聚、肾小球硬化及肾间质纤维化，因此高三酰甘油血症同样具有肾毒性，需要积极干预。

［1］Moorhead JF，Chan MK，El-nahas M，et al.Lipid nephrotoxicity in chronic progressive glomerular and tubulo-interstitial disease［J］.Lancet，1982，2:1309 － 1311.

［2］Aeberli I，Zimmermann MB，Molinari L，et al.Fructose intake is a predictor of LDL particle size in overweight schoolchildren［J］.Am J Clin Nutr，2007，86:1174 － 1178.

［3］Andersson CX，Gustafson B，Hammarstedt A，et al.Inflamed adipose tissue，insulin resistance and vascular injury［J］.Diabetes Metab Res Rev，2008，24:595 －603.

［4］Macala LJ，Yu RK，Ando S.Analysis of brain lipids by high performance thin-layer chromatography and densitometry［J］.J Lipid Res，1983，24:1243 －1250.

［5］Johnson RJ，Sanchez-Lozada LG，Nakgawa T.The effect of fructose on renal biology and disease［J］.J Am Soc Nephrol，2010，21:2036 －2039.

［6］García-Lara JM，Aguilar-Navarro S，Gutiérrez-Robledo LM，et al.The metabolic syndrome，diabetes，and Alzheimer's disease［J］.Rev Invest Clin，2010，62:343 －349.

［7］Vaziri ND，Norris K.Lipid disorders and their relevance to outcomes in chronic kidney disease［J］.Blood Purif，2011，31:189－196.

［8］Prinsen BH，de Sain-Van der Velden MG，de Koning EJ，et al.Hypertriglyceridemia in patients with chronic renal failure:possible mechanisms［J］.Kidney Int Suppl，2003，5:S121－124.

［9］Joles JA，Kunter U，Janssen U，et al.Early mechanisms of renal injury in hypercholesterolemic or hypertriglyceridemic rats［J］.J Am Soc Nephrol，2000，1:669 －683.

［10］Buemi M，Nostro L，Crascì E，et al.Statins in nephrotic syndrome:a new weapon against tissue injury［J］.Med Res Rev，2005，25:587－609.