高效液相色谱法测定亚甲基二磷酸含量

赵秀岩，王晓静，付 博，叶肇云，柳银黎

（原子高科股份有限公司，北京 102413）

亚甲基二膦酸（MDP）是双磷酸类药物，在临床上主要用于检查骨骼的血供和代谢方面的病变；经99TcO4－标记后的产品（云克）用作类风湿关节炎、强直性脊柱炎等疾病的治疗剂。由于MDP生产过程中会引入一些杂质，这些杂质（特别是亚磷酸）的存在可能会影响药物临床用药的安全有效性，而且其用量也是严格控制的，因此MDP原料药中亚磷酸含量分析是质量控制中的一项重要指标。

MDP属双磷酸类药物，是一种焦磷酸类似物，是将后者的P－O－P连接用P－C－P连接代替。由于其结构中无生色团，极性也较强，因此该类药物的质量控制一般采用重量分析法［1］、酸碱滴定法［2］、络合滴定法［3］和分光光度法［4］、柱前或柱后衍生反相高效液相色谱法［5－8］等方法。这几种分析方法的缺点是特异性较差，其中柱前或柱后衍生法较繁琐，而且仅能检测到双磷类药物，而不能对其分解产物进行检测；其他几种方法的特异性较差。本研究拟采用反相短碳链C8色谱柱以减少双膦酸在柱上的吸附，配以通用型蒸发光散射器代替传统的紫外检测器对各相关物质进行检测，以解决MDP及相关物质的分离及检测问题。

1 实验部分

1.1 主要仪器和装置

液相色谱系统：高效液相色谱仪（美国waters公司）、Alltech2000ES蒸发光散射检测器（美国奥泰公司）和CSChrom Plus色谱工作站（美国科学系统SSI公司）。

1.2 主要试剂

甲醇（色谱纯）、磷酸二氢钠和亚磷酸：均为国产分析纯；MDP 对照品：Toronto Reserch Chemicals Inc提供；正戊胺：纯度99%，美国Alfa Aesar产品。

1.3 色谱条件

色谱柱：Symmetry C8色谱柱（150mm×4.6mm，5μm）：Waters公司；流 动相：V （30 mmol／L正戊胺（用乙酸调节pH 5.0））∶V（甲醇）＝98∶2；流速：1mL／min。

蒸发光散射检测器（ELSD）：漂移管温度110℃，气体流量：2.7L／min；撞击器位置：off，增益：1。在上述条件下，MDP的理论塔板数为2 141，分离度为10.4，拖尾因子0.97。

2 实验方法

分别将磷酸二氢钠、亚磷酸、MDP对照品进样至高效液相色谱系统，采用反相高效液相色谱法分析其MDP含量，确定样品的保留时间。在相同条件下对MDP原料进行反相高效液相色谱分析。

3 结果与讨论

3.1 实验条件的确定

3.1.1 检测器的选择 MDP分子中有二个膦酸基体，极性强，易电离，分子结构中无生色团，因此不能用常规的紫外检测器或荧光检测器间接检测。由于ELSD是通用的质量型检测器，对检测室中的各种物质均有响应，它的检测不依赖于样品分子中的官能团，因此对于无生色团的磷酸、亚磷酸、MDP等有关物质可同时检测，避免了衍生对分析的干扰，因此，本工作选用ELSD作为检测器。

3.1.2 ELSD实验条件 ELSD的参数选择主要是雾化气体的流速和漂移管的温度。以信噪比为考察指标，考察了漂移管温度对检测器灵敏度的影响。结果显示，温度过低，流动相挥发不完全、噪音大、杂峰多、信噪比小；温度过高，部分样品挥发，且检测的灵敏度降低。在温度为110℃时，信噪比最大。因此选择漂移管温度为110℃。

雾化器气体流量对检测灵敏度的影响：实验发现，气体流速过小，流动相挥发不完全、背景噪音大；而流速过高，雾化形成的物质微粒小、散射能力弱、灵敏度降低。当空气流速为2.7L／min时，样品的信噪比最大，因此选择雾化器气体流量为2.7L／min。

3.1.3 离子对试剂的选择 离子对反相液相色谱常用四丁基季铵盐做离子对，但由于四丁基季铵盐不具有挥发性，因此不能直接应用于ELSD。本实验采用可挥发的正戊胺做为离子对试剂，结合ELSD检测器，克服了四丁基季铵盐离子对流动性与ELSD不相匹配的缺点。

3.2 影响色谱行为的因素

在反相高效液相色谱中，影响物质在色谱柱上保留的主要因素包括流动相的pH、流动相的浓度、流动相中有机溶剂及无机溶剂的比例，通过实验考察了以上各因素对有关物质色谱峰的影响，并确定实验的最佳条件。

3.2.1 pH对分离的影响 配制浓度30mol／L的正戊胺溶液，用乙酸调其pH为4～7，甲醇体积含量为2%，考察不同pH对磷酸、亚磷酸及MDP保留值的影响，结果示于图1。图1显示，随着pH增加，各组分保留值增加。谱峰变宽，当pH为5.0时，谱峰最佳，且满足分离要求，因此选择流动相的pH为5.0。

3.2.2 流动相浓度的影响 分别配制浓度为25～40mmol／L正戊胺溶液（用乙酸调节pH至5.0），甲醇体积含量为2%，考察不同流动相浓度对磷酸、亚磷酸及MDP保留值的影响，结果示于图2。图2显示，随着流动相浓度的增加，各组分的保留值减小，磷酸及亚磷酸分离变差。为保证充分的分离，选用浓度30mol／L的正戊胺溶液。

3.2.3 甲醇含量的影响 甲醇体积含量为0～5%时对各组分的影响结果示于图3。由图3可以看出，随着甲醇体积含量的增加，各组分的保留值减小，为保证各组分的充分分离，选用甲醇体积含量为2%。

3.3 最佳条件下的色谱分析

选用30mmol／L的正戊胺，pH 5.0，甲醇体积含量为2%时，MDP、磷酸及亚磷酸的色谱分离结果示于图4。由图4可以看出，MDP与其相关物质在合适的保留时间内达到良好的分离。

图1 pH对保留值的影响▲——MDP；■——亚磷酸；◆——磷酸

图2 流动相浓度对保留值的影响▲——MDP；■——亚磷酸；◆——磷酸

图3 甲醇体积含量对保留值的影响▲——MDP；■——亚磷酸；◆——磷酸

图4 MDP与相关物质的分离色谱图1——磷酸；2——亚磷酸；3——MDP

3.4 线性范围

MDP在600～4 000mg／L范围内峰面积A的对数值lgA浓度C对数值lgC呈现良好的线性关系，线性回归方程为：lgA＝1.943 6lgC＋16.212，r＝0.999 6，检出限为200mg／L。

3.5 精密度与重复性

在优化色谱条件下，取浓度为2.07g／L的MDP对照品溶液，连续进样6次，MDP峰面积的相对偏差为1.07%。

3.6 回收率

取浓度为920mg／L和299mg／L MDP对照品溶液，按两点法进样进行色谱分析，并对分析结果进行线性回归，另外配制3个已知浓度的MDP对照品溶液，做空白加样回收，结果列于表1。由表1可以看出，回收率为98%～102%，符合检测要求。

3.7 样品测定

采用两点法进样，对三批样品进行测量，结果列于表2。由表2可见，MDP质量含量为95.0%～98.1%，符合检测要求。

表1 加样回收率（n＝3）

表2 样品测量结果（n＝3）

4 结 论

采用反相高效液相色谱法／ELSD测定MDP及有关物质，方法的线性范围为600～4 000mg／L，r＝0.999 6，检出限为200mg／L，回收率在98%～102%，适用于MDP原料的质量控制。

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