HPLC法定量测定原乳中青霉素钾酶解产物的研究

高 颀，鲍晓瑾，倪炜华

（嘉兴市产品质量监督检验所，浙江 嘉兴 314050）

0 引 言

目前市场上出现一种抗生素分解剂，其成分为β-内酰胺酶，可分解乳中残留β-内酰胺类抗生素，致使原本残留的超标抗生素无法检出，使“有抗奶”变成“无抗奶”进入市场。β-内酰胺酶以其水解对象可分为青霉素酶、头孢菌素酶等。其中最为常用的青霉素酶能裂解乳中青霉素使其降解形成青霉噻唑酸，通过对青霉噻唑酸的测定，就可证实原料乳中青霉素以及β-内酰胺酶的存在。

对于青霉噻唑酸的测定，传统方法有碘量法、pH计法、微生物法、HPLC法等，但这些方法各有其局限性。其中碘量法对条件要求较严格，极易因见光而造成误差[1]；pH计法[2]可能受其他阳离子的干扰；微生物法[3]可以定性定量地检测乳中的β-内酰胺酶，但耗时长，操作复杂，容易造成污染而导致误差；HPLC法目前仅限于对青霉噻唑酸作为副产物来定性。本文将利用HPLC法对青霉噻唑酸进行定量测定，为探究原料乳中青霉素以及β-内酰胺酶的存在及其含量做技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

试剂：无水乙醇（分析纯，上海国药）、磷酸二氢钠（分析纯，上海国药）、甲醇（色谱纯，天地）、青霉素钾标准品（98.0%，Wako）、青霉素酶（Tokyo Chemical Industry Co.Ltd.）、青霉噻唑酸钾（自制）。

仪器：电子分析天平（德国赛多利斯）、高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）、高效液相色谱仪（Agilent 1100）。

1.2 试验方法

1.2.1 青霉噻唑酸钾标准工作液的配制

青霉素钾在酶的存在或碱性条件下均会生成等量的青霉噻唑酸钾[4-10]，因此通过HPLC法对照青霉素钾在碱性条件与酶作用下的产物，判断是否为同一种物质即青霉噻唑酸钾，可用于标准溶液的配制。方法：配制相同浓度的青霉素钾溶液，一份加入青霉素酶1mL，室温下水解2h；另一份加入氢氧化钾（KOH），调整pH值为12，室温下水解2h，最后用HPLC进行测定。

1.2.2 HPLC法对青霉噻唑酸钾检测方法研究

牛乳去脂肪、去蛋白质后，青霉噻唑酸钾可被提取，经高效液相色谱检测其含量。具体操作：称取30 mL样品，于100 mL离心管中离心10 min（4℃，10 000 r/min），小心去除脂肪层，准确吸取10 mL脱脂牛乳于100 mL离心管，加入10 mL无水乙醇，离心10 min（4℃，10000r/min），取上清液过0.22μm有机滤膜待测。

液相条件：

色谱柱为 ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm×5 μm）；

流动相为甲醇∶磷酸二氢钠（18g/L pH=4.5）=1∶1；

紫外检测器波长为230nm；流速为1mL/min；柱温为30℃；进样量为20μL。

1.2.3 标准物质定性及标准曲线测定

按1.2.2色谱条件，对青霉素钾、青霉素酶、青霉噻唑酸钾进行定性研究，观察3种物质出峰时间是否互相干扰。将浓度100mg/L的青霉噻唑酸钾标准溶液分别稀释至 2，6，10，20，60mg/L，用峰面积与浓度进行线性回归制成标准曲线。

1.2.4 回收率与精密度试验

分别在3份30mL牛乳样品中加入青霉噻唑酸钾0.5，1，2mg，按1.2.2方法提取牛乳中青霉噻唑酸钾，每一水平作3次平行，以峰面积定量计算方法回收率，同一水平计算精密度。

1.2.5 方法检出限测定

将含青霉噻唑酸钾浓度1mg/L的3份不同牛乳样品，按1.2.2方法进行提取检测，同一样品连续进样6次，以信噪比=3计算该方法检出限浓度。

1.2.6 实际样品检测试验

从不同奶站抽取6份样品进行双试样检测，按1.2.2方法处理并测定青霉噻唑酸钾含量。

2 结果与讨论

2.1 青霉噻唑酸钾配制方法

由图1、图2可知，青霉素钾在碱性条件下与在酶作用下产物保留时间一致，峰面积基本相同，由此可知青霉素钾在碱性条件下水解产物即为青霉噻唑酸钾；因此，试验用标准溶液均采用青霉素钾在pH=12条件下降解产物进行配制。

图1 青霉素钾在pH=12时降解产物图谱

图2 青霉素酶作用于青霉素钾后产物图谱

2.2 标准物质定性

经HPLC定性检测后，青霉素钾、青霉素酶、青霉噻唑酸钾3种物质的保留时间分别为7.182，5.875，4.904 min，因此3种物质在分析过程中不会造成互相干扰。

2.3 液相色谱法对青霉噻唑酸钾检测方法研究

检测结果见图3和图4。在添加青霉素酶后，样品中的青霉素钾不再检出，青霉噻唑酸钾则从样品中检出。此方法前处理简单，能有效去除脂肪和蛋白质等大分子物质，青霉噻唑酸钾分离度＞1.5。该方法优势在于简单快速，全过程控制在30min内，有效避免因青霉噻唑酸钾降解所带来的含量损失，为准确定量提供保证。

2.4 标准曲线、回收率与精密度、检出限试验

在2～60 mg/L范围内，青霉噻唑酸钾线性较好，相关系数为0.99990（n=5），回收率试验结果见表1。结果表明，在浓度16.7～66.7mg/L范围内，回收率均在85%以上，组间相对标准偏差均在10%以内。以信噪比为3计算仪器检出限浓度为0.1 mg/L，按1.2.2前处理换算方法检出限为0.2mg/L。

图3 空白牛乳+青霉素钾图谱

图4 空白牛乳+青霉素钾+青霉素酶

2.5 实际样品检验测试

表2为对6份样品检测后的结果，结果表明阳性样品可通过本方法被筛选出来，并得到青霉噻唑酸钾含量。

表1 不同加标量下的回收率及精密度

表2 高效液相法对原料乳的抽检结果

3 结束语

根据以上结果，基本建立原料乳中青霉噻唑酸钾的HPLC定量检测方法，由此可作为判断原料乳中是否添加β-内酰胺酶的依据。该方法与传统方法相比，准确度较高，检测时间控制在10min之内，并且前处理方法简单，有效降低因青霉噻唑酸钾自身降解而造成的含量损失，适合大通量检测。通过青霉噻唑酸钾含量的确定，可进一步研究其在适当条件下的降解规律，从而为以青霉噻唑酸钾为主要因子准确表征原料乳中青霉素酶添加含量的研究做技术支撑。

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