HPLC 法同时测定复方克霉唑乳膏中2 种成分的含量

柳 杰，陈艳伟，辛翠群，王春富*

复方克霉唑乳膏为我院制剂，由克霉唑和丙酸氯倍他索加适量基质制成。复方克霉唑乳膏属于抗真菌药，皮肤科主要用于治疗皮肤癣病、急慢性湿疹、脂溢性皮炎等皮肤病。为了有效地控制产品质量，笔者通过参考相关文献［1-4］，摸索实验条件，建立了同时测定制剂中克霉唑和丙酸氯倍他索含量的高效液相色谱方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 日本岛津LC-2010C HT 高效液相色谱仪，伊利特Hypersil BDS-C18色谱柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm)，UV Detector 检测器，LC Solution工作站;赛多利斯仪器(北京)有限公司万分之一分析天平;DelTA320PH 计;SK-1 快速型混匀器;HH-W420 数显三用恒温水箱;津腾溶液过滤器。

1.2试药克霉唑对照品(批号:100037-200306)，丙酸氯倍他索对照品(批号:100302-200602)，均购于中国药品生物制品检定所;复方克霉唑乳膏(克霉唑30 mg/g，丙酸氯倍他索0.5 mg/g)，大连医科大学附属第一医院制剂室，批号:20110807、20110808、20110809;克霉唑，广州市汉普医药有限公司，批号:国药准字H44022613;丙酸氯倍他索，天津天药业股份有限公司，批号:NCBP100902;乳膏基质，天津市天骄制药有限公司，批号:2011502;蒸馏水，自制蒸馏水，经0.22 μm微孔滤膜滤过;磷酸二氢钾(分析纯)，沈阳市新西试剂厂，批号:20070520;磷酸(分析纯)，天津市化学试剂六厂，批号:840404;甲醇(色谱纯)，美国天地公司，批号:1010910。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为伊利特Hypersil BDSC18柱(4.6 mm × 150 mm，5 μm);流动相为0.05 mol/mL磷酸二氢钾溶液(用10%磷酸调节pH 值至3.8)-甲醇-乙二胺(25∶75∶0.2);流速为0.8 mL/min;检测波长为240 nm;柱温为30 ℃;进样量20 μL。理论塔板数克霉唑峰和丙酸氯倍他索峰均不低于5 000，克霉唑峰和丙酸氯倍他索峰的分离度大于2。

2.2 复方克霉唑乳膏的处方 克霉唑粉30 g;丙酸氯倍他索粉0.5 g;乳剂基质加至1 000 g。

2.3 溶液的制备

2.3.1 流动相溶液的制备 称取磷酸二氢钾6.81 g，置于1 000 mL 容量瓶中，加水溶解定容至刻度，超声5 min，用溶液过滤器过滤。

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取克霉唑对照品12 mg 和丙酸氯倍他索对照品11 mg，分别置于10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，得浓度为1.20 mg/mL 克霉唑储备液和1.10 mg/mL丙酸氯倍他索储备液。分别取3 mL 克霉唑储备液和50 μL 丙酸氯倍他索储备液，置于10 mL 容量瓶中，加入4.5 mL 甲醇，以水定容，即得克霉唑和丙酸氯倍他索浓度分别为360 μg/mL 和5.50 μg/mL的混合对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备 精密称取复方克霉唑乳膏1 g(约相当于克霉唑30 mg 和丙酸氯倍他索0.5 mg)，置于100 mL 容量瓶中，加甲醇75 mL，置于70 ℃水浴中加热5 min，时时振摇，取出后强烈振摇5 min，放至室温，加水至接近容量瓶刻度线，放至室温后以水定容，摇匀，置冰箱中冷藏2 h，取出后先摇匀，立即用孔径0.2 μm 滤膜过滤，取续滤液放至室温，取20 μL 进样。

2.3.4 空白溶液的制备 取空白乳膏基质1 g，按“2.3.3”项下制备，取20 μL 进样。

2.4 干扰试验 按“2.1”项下的色谱条件，分别取空白溶液、对照品溶液及供试品溶液适量进样，记录色谱图，结果如图1。各峰之间分离度良好，结果表明，空白基质对克霉唑和丙酸氯倍他索测定无干扰。

2.5 线性关系考察 精密量取“2.3.2”项下方法配制的克霉唑和丙酸氯倍他索混合对照品溶液，分别进样5、10、20、30 和40 μL，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，分别以克霉唑和丙酸氯倍他索的质量浓度(X，μg/mL)为纵坐标，以峰面积(Y)为横坐标，做标准曲线，进行回归分析。结果表明，克霉唑和丙酸氯倍他索分别在90.0 ～720.0 μg/mL和1.38 ～11.0 μg/mL 浓度范围线性关系良好，回归方程分别为Y =1.28 ×10-4X-14.6(r =0.999 8)，Y =183 ×10-5X + 2.40 ×10-2(r=0.999 9)。

2.6 精密度试验 精密量取“2.3.2”项下方法配制的克霉唑和丙酸氯倍他索混合对照品溶液20 μL，按“2.1”项色谱条件重复进样6 次。结果克霉唑和丙酸氯倍他索的RSD 分别为0.5% 和1.6%。表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验 精密量取同一供试品溶液20 μL，在“2.1”项下色谱条件下，分别于0、1、2、4 h进样，记录色谱图。结果克霉唑和丙酸氯倍他索稳定性RSD 分别为1.7%和0.2%。表明供试品溶液在4 h 内稳定。

图1 三种溶液的HPLC 图谱

2.8 重复性试验 取同一份复方克霉唑乳膏，精密称取6 份，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进行平行测定。结果克霉唑和丙酸氯倍他索的重复性分别为0.6%和1.1%，表明此方法重复性良好。

2.9 回收率试验 精密称取丙酸氯倍他索对照品25 mg，置于25 mL 容量瓶中，加适量甲醇溶解并稀释至刻度，得1 mg/mL 丙酸氯倍他索对照品溶液。精密称取克霉唑对照品300 mg，置于100 mL容量瓶中，得3 mg/mL 克霉唑对照品溶液。称取9 份空白乳膏基质约1 g，分别准确加入浓度为1 mg/mL 丙酸氯倍他索对照品溶液各400、500、600 μL 和浓度为3 mg/mL 克霉唑对照品溶液各8、10、12 mL，每种浓度各3 份，分别置于100 mL 容量瓶中，按“2.3.3”项下方法制备，按“2.1”项下色谱条件进样，记录峰面积，计算各自的回收率，结果如表1 所示。

表1 克霉唑和丙酸氯倍他索回收率试验

样品含量测定:取3 批复方克霉唑乳膏，各取3 个样品，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，依“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图，按外标法以峰面积计算样品的含量，结果见表2。

表2 样品的含量测定

3 讨论

在《中华人民共和国药典》2010 年版二部中，克霉唑乳膏和丙酸氯倍他索均采用高效液相色谱法来进行含量测定。但两者的色谱条件各不相同，前者以甲醇-0.05 mol/L 磷酸二氢钾溶液(70∶30)(用10%磷酸调节pH 值至5.7 ～5.8)为流动相，检测波长为215 nm;后者以甲醇-水(65∶35)为流动相，检测波长则为240 nm。为了同时检测复方克霉唑乳膏中的克霉唑和丙酸氯倍他索，笔者尝试了以甲醇-0.05 mol/L 磷酸二氢钾溶液(70 ∶30)(用10%磷酸调节pH 值至5.7)为流动相，发现在此条件下，克霉唑峰和丙酸氯倍他索峰不能与杂质峰分离，而且克霉唑拖尾严重。经过尝试调节流动相pH 值，发现pH 值越小，保留时间越短，并且，加入0.2%的乙二胺后，有效抑制了克霉唑拖尾。最终确立以0.05 mol/L 磷酸二氢钾溶液(10%磷酸调节pH 值至3.8)-甲醇-乙二胺(25∶75∶0.2)为流动相，克霉唑、丙酸氯倍他索与杂质峰有效分离。由于样品中丙酸氯倍他索含量较克霉唑少且响应较低，为同时测定克霉唑和丙酸氯倍他索，选择了丙酸氯倍他索有较强吸收的240 nm 为检测波长。

本法测得复方克霉唑乳膏中克霉唑和丙酸氯倍他索的含量分别为标示量的99.5%、98.2%，且操作简便，结果准确，精密度高，可以同时测定复方克霉唑乳膏中的克霉唑和丙酸氯倍他索，可用于该制剂的质量控制。

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:102，320-321，580-581.

［2］ 王勇. HPLC 法测定复方克霉唑乳膏中二苯基-(2-氯苯基)甲醇和克霉唑的含量［J］. 中国药品标准，2010，11(3):227-230.

［3］ 胡守莲，范玉峰.HPLC 法测定丙酸氯倍他索尿素乳膏中丙酸氯倍他索的含量［J］.药品鉴定，2009，6(22):74-75.

［4］ 李亦蕾，钟震邦，郑萍，等.高效液相色谱法测定复方酮氯乳膏中酮康唑和丙酸氯倍他索的含量［J］. 医药导报，2010，29(9):1216-1218.