荧光定量PCR检测病理组织中结核分枝杆菌的临床价值

余 琦，李 宁，宋业颖，李彩云，杨江辉 (解放军第309医院病理科，北京 100091)

结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)引起的结核病为世界三大传染病之一［1］。近年来，我国结核病发病率持续上升，肺结核患病人数居全球第二位，结核病的发病率和死亡率在我国27种法定传染病中均占据首位。传统的结核杆菌检测法如细菌培养法、抗酸染色法等检测时间周期较长，或阳性率低，漏检率较高。为了克服以往检测方法的固有缺陷，需要发展敏感性高、特异性强的结核杆菌快速检测技术［2］。随着分子生物学技术的成熟发展，荧光定量PCR(FQPCR)技术已被广泛应用于各种临床病原体的检测。本文采用FQ-PCR检测法对石蜡包埋病理组织中的结核分枝杆菌DNA(TB-DNA)进行检测，并与抗酸染色和组织病理形态学检查进行比较，评价其在结核分枝杆菌检测中的临床应用价值［3］。

1 资料与方法

1.1 标本来源

2011年2月至2012年2月期间我院临床诊断肺结核的病理组织石蜡包埋标本196例，其中肺穿刺活检组织标本62例，胸膜活检组织标本60例，淋巴结穿刺活检标本30例，支气管活检组织标本46例。

1.2 主要试剂与仪器

TB-DNA探针及引物试剂盒(北京新基永康基因科技有限公司提供)，SLAN全自动荧光定量PCR检测仪(上海宏石医疗科技有限公司提供)，苯酚品红染液，4%NaOH溶液。

1.3 PCR 检测方法

将蜡块组织切取5μm薄片装入EP管中，每切取1例标本之后，即采用0.3%次氯酸钠消毒液清洁刀口及周围部分，防止污染，将EP管中加入220μl buffer TL，90℃ 1 h。室温放置1 min，12000 r/min离心2 min，小心穿过石蜡层，吸取200μl液体(包含组织)转至新的1.5 mL EP管，加入20μl OB蛋白酶，简短离心，收集管盖上液体。55℃水浴2 h，以组织基本都消化为准;中间每隔20 min混匀1次;室温12000 r/min离心2 min，转移上清至新的1.5 mL离心管，加入220μl buffer BL和4μl linear acrylamide，颠倒混匀，简短离心，收集管盖上液体，70℃水浴10 min。加入220μl无水乙醇，颠倒充分混匀;转移混合液至HiBind柱中，放置1 min;室温8000 r/min离心30 s，弃去滤液;加入500μl HB buffer，放置1 min;室温8000 r/min离心30 s，弃去滤液;加入 500 μl DNA washing buffer，放置1 min;室温8000 r/min离心30 s，弃去滤液;室温12000 r/min离心2 min，以尽量去除DNA吸附膜上的乙醇;将柱子装到新的无菌1.5 mL EP中，加入70℃预热的Elution buffer 50μl，室温静置2 min，12000 r/min离心2 min;将提取好的组织DNA与配制好的PCR扩增试剂混匀，按顺序置于PCR仪上，编辑样本信息，设定循环参数。

1.4 抗酸染色检测方法

石蜡包埋组织3μm切片，常规二甲苯脱蜡入水。将配制好的苯酚品红溶液滴加在组织切片上，放入湿盒，常温下染色10 min。切片入流水冲洗3 min，常规酒精脱水，中性树胶封片。

1.5 病理组织学检测

以病理最终诊断报告中出现“符合结核病变”作为阳性结果判定标准，否则判定为阴性结果。

1.6 统计学方法

采用SPSS11.0统计软件进行统计分析，定性资料采用百分率表示，组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差别具有统计学意义。

2 结果

在196例临床诊断结核阳性样本中，应用FQ-PCR法(图1)、抗酸染色法(图2)和组织病理学检测的阳性率分别为69.39%、35.20% 和 52.04%，三者阳性率比较有统计学意义(P＜0.01)，见表1。不同部位组织在不同检测方法中的阳性例数见表2。

表1 三种方法对196例阳性样本的检测情况

表2 三种方法检测不同部位组织的阳性例数(n)

图1 荧光定量PCR(熔解曲线法)检测结果

图2 支气管结核干酪样坏死中阳性杆菌(抗酸染色 ×400)

3 讨论

结核病是结核分枝杆菌感染引起的一种慢性传染病，已成为全球性公共卫生问题［4］。临床诊断工作中通常需要病理诊断来确定病变是否为结核分枝杆菌感染，从而确定治疗方案。抗酸染色检测法的优点是简便、快速、价廉，缺点是特异性差，不能区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌［5］，容易造成漏诊和误诊。传统组织病理学依据组织形态学改变，如肉芽肿病变、坏死的特点等，在缺乏典型的组织形态特点时往往难以确诊，不能及时有效地为临床治疗提供有利的诊断依据。PCR方法已广泛应用于微生物检测和研究［6］。近年出现的FQ-PCR技术，是将实时荧光监测与普通PCR技术相结合，能够对目标微生物进行实时定量检测，已被成功用于微生物快速定量检测［7-8］。本研究采用分枝杆菌菌种DNA探针鉴定产品，检测试剂以Real-time PCR仪为平台，利用不对称PCR扩增技术，通过分析比较特异的荧光标记寡核苷酸探针同与其完全互补单链PCR产物(结核分枝杆菌)以及存在错配的单链PCR产物(非结核分枝杆菌)结合所产生熔解曲线Tm值的变化，来检测标本中是否存在分枝杆菌感染，并区分结核分枝杆菌(复合群)与非结核分枝杆菌(NTM)。当发生NTM感染时，其熔解曲线峰所示的Tm值与结核分枝杆菌相比会有所降低。该方法将TagMan探针技术和实时荧光定量PCR技术相结合，即能鉴定是否有分枝杆菌感染，还能对菌株进行分型。按照结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的特异性序列设计引物和探针，分别标记不同的荧光。当反应体系中有目的基因存在时，随着PCR反应的进行，就会释放出荧光，通过实时监测不同通道的荧光信号，可以进行结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌两者的区分鉴定。具有检测速度快，灵敏度高，准确度高的特性。本研究还比对了不同部位组织中用不同方法的阳性检出率，FQ-PCR检测法的阳性检出率均高于其他检测方法，这说明了荧光探针杂交检测具有较高的特异性［9］，在李秀斌等［10］报道中病理诊断为结核者石蜡包埋组织TB-DNA阳性率为93.14%，也支持了本研究的观点。

综上所述，FQ-PCR检测石蜡切片组织标本的TBDNA，具有简便、灵敏、特异的优点，与病理学检查相结合，可进一步提高病理组织中结核分枝杆菌感染诊断的准确度和特异性，适合临床检验和实验室应用，在结核病的早期诊断上具有临床实用价值［11］。

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