大鼠缺氧缺血脑组织AQP-4蛋白和AQP-4mRNA表达的研究

付学锋，张新宇，万东君，林 宏，李柱一 (.兰州军区兰州总医院干三科，甘肃兰州 730050;.第四军医大学唐都医院神经内科，陕西西安 70038)

水通道蛋白(aquaporins，AQPs)是细胞屏障中膜转移通道的蛋白质，溶于水并在细胞和它周围环境间运动。脑水肿是围生期缺氧缺血性脑损伤(hypoxicischemic brain damage，HIBD)的病理生理发生过程中最基本和重要的改变，而水通道蛋白-4(AQP-4)在组织器官水肿发生的分子机制中发挥重要作用［1-3］。我们用大鼠建立HIBD动物模型，检测大鼠脑组织AQP-4蛋白和AQP-4mRNA表达情况，以探讨AQP-4在HIBD脑水肿病理生理发生发展中的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

选用体质量为210～240 g健康雄性SD大鼠60只，随机分为HIBD模型组和对照组，每组30只。HIBD组采用手术方法结扎右颈总动脉进行缺氧处理，对照组不结扎右颈总动脉，其余同HIBD组。于术后0 h、6 h、1 d、2 d和3 d时间点，用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉动物，开胸后，用注射器于左心室注入生理盐水10 mL，同时剪断颈外静脉直至流出液变清，再注入4%多聚甲醛(pH=7.4)10 mL后，立即断头取出全脑置于4%多聚甲醛固定7 d后备用。

1.2 方法

将固定后的鼠脑从垂体水平沿冠状位分成前后两部分并用全自动脱水机脱水，石蜡包埋后进行冠状位切片，经HE染色后进行光镜观察病理变化。于0 h、6 h、1 d、2 d和3 d分别取对照组和HIBD脑组织并进行适当改良提取蛋白备用［4］。采用Western Blot方法测定蛋白，先进行蛋白质单向SDS凝胶电泳，然后进行图像采集，测定其光密度(IOD)值。目的基因cDNA片断的扩增:引物由上海生物工程公司合成并经质量检测，采用上海申能博彩公司的 Two-Step RT-PCR kit，在 PE-9600 PCR仪上进行目的基因扩增，得到模板cDNA。荧光定量PCR检测:制备标准动力学曲线确定目的基因在脑组织中的表达，检测待测样品的Ct值。

1.3 统计学处理

分别用IOD值和Ct值作为AQP-4蛋白和AQP-4mRNA表达的参数进行统计分析。数据采用均数±标准差±s)表示，使用SPSS13.0软件进行分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病理变化

开颅后，可见HIBD组的右侧脑组织向左膨出，并有肿胀，脑回增宽和脑沟变浅，而对照组无变化。光镜下观察结果见图1。HIBD组6 h～1 d可见少量神经元胞体肿胀，少量胶质细胞增生，细胞间隙增宽，2～3 d上述病变更加明显，同时有细胞排列杂乱，神经元变性，一些神经细胞核固缩且有强嗜碱性，胞质红染加深，胶质细胞明显增生，在3 d时可见明显梗死灶。

2.2 蛋白表达

与对照组比较，HIBD组脑组织0 h时AQP-4蛋白表达无变化，6 h后开始逐渐下降，其中2 d下降明显，3 d后开始回升。HIBD在6 h、1 d、2 d和3 d各时间点IOD值均较对照组低，结果见表1。

2.3 AQP-4mRNA 表达

常规PCR测定AQP4mRNA扩增产物，脑组织中各时间点AQP-4mRNA表达结果见表2，结果显示0 h变化不明显，6 h、1～3 d均较对照组低，2 d时最低，3 d开始回升。

3 讨论

脑创伤、脑肿瘤和脑缺血继发性脑水肿的病理生理过程均有AQP-4参与［5-7］。无AQP-4基因大鼠脑缺血引起的脑水肿不明显，提示抑制AQP-4表达可能达到治疗脑水肿的目的［6-9］。脑组织周围的缺血缺氧可破坏血脑屏障，导致细胞外大量兴奋性谷氨酸的积累，从而激活谷氨酸受体引起大量Ca2+的细胞内流，促使Ca2+敏感酶活性增加，产生大量自由基导致线粒体损伤，细胞发生凋亡或坏死［10］。艾芬地尔和硫酸镁可减轻谷氨酸对血脑屏障的破坏，下调AQP-4的表达，使局灶性缺血和创伤性脑损伤面积减少，减轻脑水肿，从而认为减轻水肿可能是通过下调AQP-4表达实现的。

图1 HIBD不同时间AQP-4表达的免疫组化染色(×400)

表1 脑组织AQP-4蛋白条带的IOD值(±s，n=6)

表1 脑组织AQP-4蛋白条带的IOD值(±s，n=6)

*:与对照组比较，P ＜0.01

表2 脑组织AQP-4mRNA表达±s，n=6)

表2 脑组织AQP-4mRNA表达±s，n=6)

*:与对照组比较，P ＜0.01

AQP-4在保持中枢神经系统水、电解质平衡中起重要作用［8-10］。我们发现 HIBD早期 AQP-4表达减少，3 d后AQP-4表达出现回升趋势，这一过程同时伴有脑损伤、脑水肿改变，提示大鼠HIBD脑水肿与脑组织中AQP-4表达有一定关系，AQP-4可能对HIBD脑水肿的发生发展起调控作用［1-3］。脑组织缺氧缺血时AQP-4表达降低，多数研究认为AQP-4可能通过调节依赖蛋白激酶C和A(PKC，PKA)而发挥作用。脑组织缺血缺氧时，通过氧化磷酸化和激活PKC和PKA使AQP-4磷酸化失活、表达降低［10］。PKC和 PKA被激活后，可从胞质转移到胞膜，并使AQP-4蛋白磷酸化，这时水的渗透性发生改变，形成或加重脑水肿。但真正的调控机制尚不清楚，还需进一步研究。

［1］ 赵应敏，宋 波，许予明.AQP4与脑水肿［J］.临床和实验医学杂志，2007，6(5):164 －165.

［2］ 摩驭国.水通道蛋白4在大鼠外伤性脑损伤的表达及意义［J］.湖南中医药大学学报，2010，30(6):7 －8.

［3］ 谭美芸.水通道AQP1的研究进展［J］.中国实用医药，2010，5(9):241－243.

［4］ 张志灯，曹治云，郑 腾，等.改良的大鼠脑组织总RNA抽提方法［J］.生物技术通讯，2006，17(5):760 －761.

［5］ 何 玲，王 键，胡建鹏.活血利水法对大鼠缺血性脑水肿脑组织内AQP-1和AQP-9表达的影响［J］.中国中医急症，2011，20(4):580－581.

［6］ 陈宝智，王宇田，赵建农，等.颅脑外伤早期与AQP4表达的研究进展［J］.中国热带医学，2010，10(3):380 －381.

［7］ Zhang YW，Li HT，Hu J，et al.Correlation analysis between the expression of aquaporin 4 and magnetic resonance imaging of brain tissue in severely scalded rabbit with brain edema during early stage［J］.Zhonghua Shao Shang Za Zhi，2011，27(6):441 －445.

［8］ 孟 飞，衣服新，叶志军，等.艾芬地尔对大鼠局灶性脑缺血损伤后脑水肿和AQP4表达的影响［J］.神经解剖学杂志，2010，26(2):192－196.

［9］ 李 琴，张 红，毕明俊，等.神经调节素对大鼠脑缺血再灌注损伤AQP-4及GFAP表达的影响［J］.神经解剖学杂志，2009，25(1):30－36.

［10］ Wang LQ，Zhu SM，Zhou HJ，et al.Expression of aquaporin-4 during brain edema in rats with thioacetamide-induced acute encephalopathy［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2011，91(36):2573 － 2577.