普通环境下使用生物安全笼盒BSC系统进行SPF级小鼠的繁殖研究

隋世燕，宋艳秋，蒋 梅，顾志明，唐金珍

（1.大理学院实验动物中心，云南大理 671000；2.大理学院公共卫生学院，云南大理 671000；3.大理学院临床医学院，云南大理 671000；4.苏杭科技器材有限公司，江苏苏州 215001）

普通环境下饲养繁殖的动物，容易受病原微生物和寄生虫的侵害，影响实验结果的准确性和可重复性。在屏障系统内繁育无特定病原体（Specific Pathogen-free，SPF）级大小鼠投资大，建设周期长，运行费用高，一些单位无力建设和使用。而具有微型屏障系统功能的独立通气笼盒（Individually Ventilated Cages，IVC）虽具有节能环保、操作方便的功能〔1〕，但IVC在普通环境内使用需要搬运到超净工作台内给水、给料、换垫料等操作，喷酸消毒作业对动物影响大，稍有操作不规范易将笼内动物污染。而生物安全笼盒（Biological Safety Cage，BSC）是将IVC笼盒饲养在一个负压净化环境和生物安全柜内，解决了以上存在的难题。

BSC系统由负压净化实验台、独立通气笼盒IVC笼架（小鼠3层×6=18笼）、IVC笼盒、电器控制系统及监视系统组成。主要应用于生命科学和生物医药研究，在普通环境内依照严格的实验室操作规范操作即可饲养SPF大小鼠开展低危感染性动物实验，一机二用。实验人员无须穿戴多层防护服，实验过程舒适。具有节能环保、保护实验人员的健康与安全，防止人畜共患疾病的发生，防止动物之间交叉感染，保证动物实验结果的准确性等优点〔2-7〕。

本课题探讨在普通环境下使用BSC系统繁育SPF级小鼠的可行性，摸索其操作规程，为BSC系统的普及提供参考数据。

1 材料及方法

1.1实验材料

1.1.1 器材与试剂 BSC系统（苏州苏杭科技器材有限公司，BSCM18）、高压消毒锅（山东淄博新华压力容器厂）、酶标仪（普朗医疗，型号：9602A）、加湿器（杭州正岛电器设备有限公司，ZS-40Z型）、抗弓形虫抗体检测试剂盒（福建三明蓝波生物技术研究所，批号：04070111）、2%过氧乙酸（西安洁立达精细化工有限公司，批号：20090510）、空调、温度计、无菌衣、一次性口罩、手套和帽子等。

1.1.2 实验动物 SPF级小鼠，18～21 g，共60只，雄鼠15只，雌鼠45只，购自第三军医大学，生产许可证号：SCXK（渝）2007－017，购入后在BSC系统中进行饲养。

1.2实验方法

1.2.1 饲料、垫料、饮水的消毒 饲料、垫料用包装袋包装，饮水为自来水，用水瓶分装，包装布包装，经121℃高压蒸气灭菌30 min。

1.2.2 BSC系统饲育小鼠 购入小鼠使用SPF级包装，小鼠到达前24 h，BSC系统房间全面使用2%过氧乙酸喷雾消毒，前12 h，打开室内紫外线灯，小鼠到达后，鼠盒全面喷雾消毒，BSC系统提前30 min打开紫外线灯，然后在超净工作台上打开小鼠包装箱，BSC笼盒用15%过氧乙酸全面擦拭表面，将小鼠转入，添加垫料、饮水和饲料，用酒精棉球擦拭通气孔，将笼盒放回到笼架上。

1.2.3 BSC系统中小鼠的饲养管理及配种 空调控制温度在22±2℃，加湿器控制相对湿度在50±5%；操作前一天室内紫外线消毒，每隔3～5 d更换垫料、饮水、笼盒和饲料，超净工作台提前30 min打开紫外线灯，工作人员戴无菌手套，穿无菌消毒服后开始工作。一位工作人员用2%过氧乙酸擦试消毒笼具外表放在超净工作台上，另一名人员打开笼盒，换垫料和饲料，再盖好盖子，更换饮水，第一位人员用酒精棉球擦拭通气孔后将笼盒放入。将引进的SPF级小鼠60只饲养在BSC系统笼盒内，每盒3～5只。饲养2个月后挑出一部分小鼠按雌雄2∶1进行配种，记录分娩时间。

1.2.4 质量检测 将引进的60只SPF级小鼠分别在饲养1个月、2个月、3个月时随机选5只进行质量检测；子1代小鼠1月龄、2月龄、3月龄时，分别随机选取5只，依照GB14922.2－2001（SPF级标准）要求的项目进行质量检测。

体外寄生虫检测方法参照GB/T18448.1－2001；弓形虫检测使用抗弓形虫病抗体检测试剂盒；蠕虫检测方法参照GB/T18448.6－2001；鞭毛虫和纤毛虫检测方法参照GB/T18448.10-2001。

沙门菌检测方法参照GB/T14926.1－2001；支原体检测使用小鼠支原体ELISA试剂盒；鼠棒状杆菌检测使用小鼠棒状杆菌ELISA试剂盒；泰泽病原体检测使用小鼠泰泽病原体ELISA试剂盒；嗜肺巴斯德杆菌的检测方法参照GB/T14926.12-2001；肺炎克雷伯杆菌的检测方法参照GB/T14926.13-2001；金黄色葡萄球菌的检测方法参照GB/T14926.14-2001；绿脓杆菌的检测方法参照GB/T14926.17-2001。

鼠痘病毒检测使用小鼠鼠痘病毒ELISA试剂盒（厦门慧嘉生物科技有限公司）；小鼠肝炎病毒检测使用小鼠肝炎病毒ELISA试剂盒（北京富众科技发展有限公司）；仙台病毒检测使用小鼠仙台病毒ELISA试剂盒（上海宝特生命科学发展有限公司）；小鼠肺炎病毒使用小鼠肺炎病毒ELISA试剂盒（上海劲马生物科技有限公司）；呼肠孤病毒Ⅲ型使用小鼠呼肠孤病毒Ⅲ型ELISA试剂盒（上海丰翔生物科技有限公司）；小鼠细小病毒使用小鼠细小病毒ELISA试剂盒（北京鸿跃创新科技有限公司）。

1.3结果统计所有数据均用SPSS17.0软件进行分析，计算平均值与标准误。

2 结果

2.1饲料、垫料、饮水消毒情况高压蒸汽消毒锅内消毒效果检测卡显示消毒物品达到无菌状态。

2.2小鼠妊娠期小鼠妊娠期，见表1。由表1可知，BSC系统饲养小鼠的妊娠期为18.67±0.07 d，约为18.5 d，与普通环境下使用IVC繁育清洁级小鼠的妊娠期接近。

表1 小鼠妊娠期

2.3小鼠的初生重、离乳重、窝仔数和离乳率小鼠的初生重、离乳重、窝仔数及离乳率，见表2。由表2知，BSC系统饲养小鼠的初生重约为2 g，21 d离乳重14 g左右；BSC系统饲养母鼠的窝产仔数平均约为11只，离乳率达98.5%。

表2 小鼠初生重、离乳重、平均窝产仔数及离乳率

2.4质量检测共随机选出30只小鼠进行质量检测，检测的内容包括细菌、病毒和寄生虫，具体项目为沙门菌、支原体、鼠棒状杆菌、嗜肺巴斯德杆菌、肺炎克雷伯杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、泰泽病原体、鼠痘病毒、小鼠肝炎病毒、仙台病毒、小鼠肺炎病毒、呼肠孤病毒Ⅲ型、小鼠细小病毒、体外寄生虫、弓形虫、全部蠕虫、鞭毛虫和纤毛虫。结果全为阴性，说明本实验饲养的小鼠达到了SPF级水平。

3 讨论与分析

BSC系统饲养的小鼠产仔数、离乳率、初生重及离乳重均超过或接近正常屏障系统饲养的小鼠，小鼠质量检测结果全为阴性，说明在普通环境中严格控制条件的情况下，使用BSC系统繁育SPF级小鼠是完全可行的，它避免了普通环境下单独使用IVC时笼盒搬运到超净工作台时的动物污染，使生产的小鼠能够达到SPF级的要求。

如果BSC笼盒内放的小鼠过多，将使更换笼盒的间隔时间变短，而频繁更换笼盒容易被病原微生物污染；如果过长时间更换笼盒，其内卫生较差，也容易滋生细菌。通过实验发现，笼盒在3～5 d需更换一次饮水、垫料和饲料，且每个笼盒适宜饲养3～5只小鼠。

BSC系统将独立通气笼IVC和生物安全柜有机地结合在一起，在一个负压净化实验台内放置多个独立通气笼盒来饲养SPF大（小）鼠。由于采用单风机（送风机）负压净化技术同时提供实验区及笼盒内洁净空气，故使用BSC系统能确保饲养动物达到SPF级要求。

对于规模较小和使用动物频率不高的实验单位，可建立设有BSC系统的动物实验室，这样既能保证研究数据的可靠性，又能节约能源和财力。

〔1〕张海峰，卢胜明，康峰，等.独立通风笼盒（IVC）在动物实验中的应用〔J〕.实验动物科学，2011，28（6）：54-56.

〔2〕秦川.医学实验动物学〔M〕.北京：人民卫生出版社，2008.

〔3〕任萍萍，程津津，史晓萍.屏障系统实验动物环境设施建设及运行维护模式〔J〕.实验动物科学，2011，28（6）：57-58.

〔4〕柯贤福，周莎桑，楼琦，等.实验动物屏障系统微生物动态状况〔J〕.中国比较医学杂志，2010，20（3）：47-50.

〔5〕隋世燕，王林刚，赖仲辉，等.小鼠剖腹产净化方法研究〔J〕.大理学院学报，2010，9（10）：46-49.

〔6〕张洪，鲍波.浅谈国内BALB/c小鼠及KM小鼠的基本生物学特性〔J〕.中国实用医药，2010，5（3）：252-254.

〔7〕林玮，谢金东，刘德强，等.2种不同来源的饲料对小鼠生长和繁殖性能的影响〔J〕.福建中医学院学报，2010，20（4）：38-39.