瘦素对大鼠气道平滑肌细胞凋亡的影响

倪文静，朱述阳，刘文静，吴 瑕，陈云峰，赵 玲

（徐州医学院附属医院呼吸科，江苏徐州221002）

瘦素，为一种相对分子质量为16×103的激素，主要由脂肪细胞分泌，在免疫系统和炎症中起着多方面的作用［1］。瘦素与瘦素受体（OB－R）结合通过激活磷脂酰肌醇－3－OH激酶和分裂素活化的蛋白激酶（MAPK）信号通路发挥其作用［2］。瘦素浓度在过敏性气道中是增加的，可能在肥胖和哮喘的关系中起着作用［3］。但瘦素与瘦素受体的作用通路及发病机制在哮喘患者的气道中的作用仍不清楚。最新研究证实瘦素可能在促进气道炎症的同时，参与了哮喘的气道重构过程，瘦素失衡可能是肥胖哮喘小鼠气道损伤和重建的重要因素［4］。本小组前期研究表明瘦素可以促进体外培养的大鼠气道平滑肌细胞（airway smooth cells，ASMCs）的增殖［5］，但是瘦素对 ASMCs凋亡的影响尚无相关报道。本实验研究目的旨在探讨瘦素是否可通过与ASMCs上瘦素受体的结合来抑制细胞的凋亡，从而可以进一步的了解瘦素对ASMCs的作用。

1 材料与方法

1.1材料 实验动物：150～200g SD雌性大鼠2只由徐州医学院实验动物中心提供。主要试剂与仪器：细胞培养基（DMEM）购自GIbIco公司；瘦素购自Alexis公司；兔抗鼠瘦素受体的抗体BY－0961Rleptin receptor（L）购自上海博华生物科技有限公司；兔抗大鼠白血病－xl（Bcl－xl）抗体、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase－3）抗体购自北京中杉公司；Annexin VFITC/PI凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1大鼠ASMCs的培养 水合氯醛麻醉大鼠后，在无菌下剖取气管约1.5cm放入超净台，将气管段剪成1mm×1 mm的组织块，贴于培养瓶的侧面，加入含25%胎牛血清（FBS）的培养液2mL于瓶内，于37℃含5%CO2培养箱静置，3～4h之后轻轻翻转培养瓶，半开放式于培养箱中培养。3d后，添加3mL的培养液于瓶内，培养约6d可换液，此后每3天换液1次。待细胞长满瓶壁后传代培养，选第4～6代的细胞用于实验。

1.2.2细胞鉴定 （1）细胞形态学：倒置显微镜观察细胞的大小、形态及排列方式等；（2）免疫荧光染色法：把收集好的细胞加入消毒好的6孔培养板内，DMEM补齐至2mL。倒置显微镜下观察细胞融合约50%～60%时取出玻片，加3.7%甲醛液在室温下固定30min，磷酸盐缓冲液（PBS）洗2次，每次5 min，用0.1%山羊血清封闭特异性抗原30min，抗SMC－α－actin（1∶200PBS稀释）室温孵育细胞2h后，加入荧光标记二抗（1∶200PBS稀释）在4℃孵育过夜，第2天用荧光封片剂封闭后在荧光显微镜下检测。

1.2.3Western blot法检测瘦素受体蛋白 （1）分别提取未经瘦素干预和瘦素干预后的ASMCs蛋白备用。（2）用啉甲酸（BCA）蛋白实验法测量蛋白的浓度，配胶后，在每个上样孔中加入30μL的蛋白提取液，电压80V电泳，电流40mA转膜。然后把纤维膜取出，放入30g/L的封闭液中封闭3h，按一抗∶洗 涤缓冲液（Washing Buffer）∶30g/L 牛血清蛋白（BSA）＝3∶2∶1加入二抗，孵育2h，配制显色液，缓冲液（AP Buffer）∶四氮唑蓝（NBT）∶甲苯胺蓝（BCIP）＝10mL∶66μL∶33μL，加入显色液约2h，用NBT/BCIP显色后用Image J软件分析条带的灰度。

1.2.4Western blot法测定caspase－3和Bcl－xl蛋白的表达方法同上。封闭后，用washing Buffer洗涤3次，分别放入含10%的caspase－3和Bcl－xl抗体孵育，2h后配制显色液按上述方法显色后观察结果。用NBT/BCIP显色后用Image J软件分析条带的灰度值，计算 Bcl－xl/β－actin和caspase－3/β－actin的比值。

1.2.5Annexin V－FITC/PI测定细胞凋亡率 将第四代的ASMCs按1×105/孔接种于4个6孔板培养24h，再加入纯的DMEM培养24h，换1%含血清的DMEM，随机分为7组：空白对照组（A组）；20μg/mL瘦素组（B组）；40μg/mL瘦素组（C组）；60μg/mL 瘦素组（D 组）；80μg/mL 瘦素组（E 组）；100μg/mL瘦素组（F组）；100μg/mL瘦素＋BY－0961RLeptin receptor组（G组）。将细胞置于培养箱中培养48h后，用胰酶消化收集细胞离心5min。弃上清液后转移至标记好的EP管中。每管中加入Annexin V－FITC轻轻重悬细胞，加入PI避光反应10min，随即用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.3统计学处理 数据采用SPSS13.0统计软件分析，实验结果以s表示。组间比较采用单因素方差分析和q检验。相关性分析采用Pearson等级相关进行统计分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1ASMCs的鉴定 倒置显微镜放大100倍，细胞呈长梭形，贴壁平行生长，束状排列，密集与稀疏处相互交错（封4图1A）。免疫荧光染色法证明：抗平滑肌肌动蛋白抗体呈阳性染色的细胞内可见大量的绿色荧光，说明所培养的细胞为ASMCs（封4图1B）。

2.2瘦素受体的鉴定 Western blot法显示在相对分子质量（95～130）×103之间有明显的条带。见封4图2。

2.3瘦素对ASMCs凋亡的影响 瘦素分别作用于ASMCs 48h后，用流式细胞仪检测各组的凋亡率，B、C、D、E、F组细胞的凋亡率分别为（5.16±0.99）%、（3.45±0.82）%、（2.90±0.18）%、（1.68±0.87）%、（1.08±0.26）%均低于A组（6.48±0.76）%（P＜0.05），且各组细胞凋亡率与瘦素浓度呈负相关（r＝－0.992，P＜0.01），加入瘦素受体抗体的 G组细胞的凋亡率为（3.12±0.76）%，较F组明显升高（P＜0.05）。

2.4瘦素对caspase－3表达的影响 Western blot表明不同浓度瘦素处理后，ASMCs内裂解的caspase－3表达减少，并与浓度呈负相关（r＝－0.932，P＜0.01），见图3。

2.5瘦素对ASMCs内Bcl－xl蛋白的影响 Western blot结果示随着瘦素浓度的增加，对抑制细胞凋亡的Bcl－xl蛋白的表达逐渐增多，且与浓度呈正相关（r＝0.974，P＜0.01），见图4。

图4 Western blot检测各组Bcl－xl蛋白的表达

3 讨 论

在过去的几年中，许多的研究证实了瘦素在呼吸系统中潜在作用。基于这样的研究，研究者们试图证明瘦素在特殊的呼吸系统紊乱中的作用，包括慢性阻塞性肺疾病（COPD）、哮喘、肺癌。本研究证明了瘦素与瘦素受体结合抑制了大鼠ASMCs的凋亡，瘦素可以使参与细胞凋亡的蛋白caspase－3表达减少，使抑制细胞凋亡的蛋白Bcl－xl表达减少。其中瘦素抑制ASMCs凋亡的作用机制尚在研究之中。

瘦素可以通过STAT－3的活化途径体外刺激人的单核细胞增殖［6］。而且最近一篇文献已经证明了瘦素受体在大鼠ASMCs上有表达，瘦素与瘦素受体结合可体外刺激大鼠ASMCs的增殖［5］，这说明它可能在哮喘ASMCs增殖中起着一定的作用。本实验也证实了瘦素受体在大鼠ASMCs中有表达。而且肺组织中有瘦素受体基因的表达；在一些动物模型实验中也发现了肺组织上的瘦素受体［7］，更重要的是，有研究发现了肺组织细胞中有瘦素受体b型（OB－R b）的表达［8］，本实验Western blot显示在95×103与130×103之间有明显条带，与瘦素受体OB－R b 120×103的相对分子质量相符。说明ASMCs上有长型瘦素受体的表达。

有研究表明瘦素可以避免T淋巴细胞凋亡，调节T－Cell的增殖和活化，并促进血管的生成［9］。哮喘是以气道重塑为主的慢性气道炎症，主要表现为气道内上皮细胞的脱落、基底膜的增厚等，且有研究证实了瘦素本身不促进平滑肌的增殖、迁移或细胞因子的合成，这说明了肥胖对哮喘的影响不能归因于瘦素直接对ASMCs的作用［10］。

有研究证实了瘦素可以通过激活p－ERK和PI－3K的机制体外促进大鼠ASMCs细胞的增殖［5］，而对大鼠ASMCs细胞的凋亡率的影响却没有相关的研究。本实验用不同浓度的瘦素体外刺激大鼠ASMCs 48h后，用流式细胞仪检测法和Western blot法来观察瘦素对细胞凋亡的影响；结果显示了瘦素可与ASM细胞膜上的瘦素受体结合通过相应的作用机制及相应的信号转导体系而实现抑制细胞的凋亡，导致裂解的caspase－3的减少，Bcl－xl的增加，并具有明显的浓度依赖性，于100μg/mL时达到高峰，当在F组中加入BY－0961RLeptin receptor后，实验发现ASMCs的凋亡率明显升高，从而证实了BY－0961RLeptin receptor可通过与受体结合抑制瘦素对细胞的抗凋亡作用。瘦素也可以保护心肌细胞免受缺氧－再灌注或是过氧化氢诱导的凋亡［11］，说明瘦素在细胞保护中可能起着重要的作用。

caspase家族在细胞凋亡中起着至关重要的作用，caspase－3在凋亡过程中起着重要的作用，细胞凋亡的过程是caspase－3不可逆水解底物的级联放大反应过程［12］，它可直接破坏细胞结构，在细胞发生凋亡时，核纤层蛋白可被caspase－3在一个近中部的固定部位所裂解，使核纤层蛋白崩解，导致细胞凋亡。本研究发现，与对照组相比，不同浓度的瘦素干预ASMCs后，可使裂解的caspase－3蛋白表达明显增多，且与瘦素浓度呈负相关，说明caspase－3参与瘦素对ASMCs的凋亡作用。

Bcl－xl蛋白是BCL蛋白家族的成员之一，是细胞中抑制细胞凋亡的重要分子之一，Bcl－xl是结构上与Bcl－2具有43%同源性的蛋白与Bcl－2的作用相同，可抑制细胞凋亡。Bcl－xl的过度表达可引起细胞核谷胱苷肽（GSH）的积聚，导致核内氧化还原平衡的改变，从而降低caspase－3酶的活性。本研究发现不同浓度的瘦素可以通过增加Bcl－xl蛋白的表达使caspase－3蛋白减少且与瘦素浓度呈正相关（P＜0.01）。当加入瘦素受体抑制剂时，caspase－3蛋白的表达明显增多，Bcl－xl蛋白表达明显减少。这说明了二者在瘦素对ASMCs的抑制凋亡作用中发挥重要的作用，共同参与细胞的凋亡过程。

总之，瘦素可以在体外与大鼠ASMCs的瘦素受体结合，增加Bcl－xl的表达，抑制裂解caspase－3的表达，从而实现了对ASMCs的保护。其中的作用机制尚不清楚，可能是PI－3K和MAPK通路发挥其作用，这有待进一步的研究来证实。

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