硫链丝菌肽对人鼻咽癌HNE－1细胞生长及Foxm1表达的影响

林 力，邓 碧，寿 铸，梁 佳，陈鸿雁△

（1.重庆医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科 400016；2.重庆市渝北区人民医院麻醉科 401120）

硫链丝菌肽（thiostrepton，TST）是一种噻唑类抗生素，可从多株青链霉菌中分离获得［1］。最近，有研究发现TST可通过靶向作用于Forkhead box protein M1（Foxm1）转录因子抑制肿瘤细胞增殖，并且对其他转录因子的转录活性无影响；此外，用此类抗生素处理不同来源的人肿瘤细胞株，可在下调Foxml基因表达的同时诱导细胞凋亡［2］。

Foxm1是一种上调细胞增殖的转录因子，属叉头框家族（Fox家族）。有研究表明，它与胚胎发育、再生、衰老和肿瘤发生等许多病理生理过程密切相关［3］。本研究前期工作中发现Foxm1在鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）组织中高表达，与NPC的分期及转移程度呈正相关。因此，本研究从细胞角度检测Foxm1在鼻咽癌HNE－1细胞株中的表达；同时检测TST对鼻咽癌HNE－1细胞株增殖抑制的作用及可能机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1肿瘤细胞系 人鼻咽癌HNE－1细胞株（购自中科院上海细胞所）。

1.1.2试剂与药品 RPIM1640（Gibco公司），新生小牛血清（杭州四季青公司），四甲基偶氮唑盐（MTT，上海华舜生物工程有限公司），二甲亚砜（DMSO，重庆医药股份有限公司），TST（Merck公司），免疫组化SABC试剂盒、DAB显色试剂盒、山羊抗兔二抗（北京中杉公司），兔抗人Foxm1多克隆抗体（Santa Cruz公司），Western blot相关试剂（碧云天生物技术公司）。

1.2方法

1.2.1细胞培养 将HNE－1细胞接种到含10%热灭活小牛血清的RPMI1640培养液中，置37℃、5%CO2饱和湿度孵箱内培养，细胞呈单层黏壁生长。传代时用0.1%胰酶－0.02%EDTA溶液消化，台盼蓝拒染法计算成活细胞数。

1.2.2TST对HNE－1细胞体外抑制实验 取对数生长期的HNE－1细胞，胰酶消化，离心，制成细胞悬液，调整细胞数为5×104/mL。取96孔培养板，每孔加入200μL细胞悬液，加入TST，使其终浓度分别为1、2、4、8、12、16μmol/L，每一浓度重复6孔，设试剂对照组及细胞对照组，置37℃、5%CO2孵箱内培养48h。离心后，小心去除上清液，每孔加无血清培养液200μL及5mg/mL MTT 20μL继续培养4h。离心，吸去上清液，每孔加200μL DMSO，置于振荡器上振荡10min，自动酶标仪上测出各孔吸光度值［D（490）］，检测波长为490nm。上述实验均重复3次，计算细胞生长抑制率。

1.2.3TST对HNE－1细胞周期变化的影响 分别将浓度为1、2μmol/L的TST处理细胞48h后，实验设置对照组，收集HNE－1细胞，PBS洗涤2次。离心，去上清液，缓慢加入－20℃预冷的75%乙醇，固定1h。PBS洗涤2次，将等体积的细胞悬液和PI染液混合，4℃放置30min。将样品放入流式细胞仪（FCM）的样品室，以激发波长488nm测定，并用Modfit LT2.0软件分析细胞周期分布。

1.2.4免疫细胞化学法测定不同浓度TST作用于HNE－1细胞48h后Foxm1的蛋白表达 分别将终浓度为1、2μmol/L的TST处理细胞48h，同时设细胞对照组和以PBS代替Foxm1一抗的阴性对照组。参照免疫组化SABC试剂盒说明书进行。

1.2.5Western blot检测细胞Foxm1蛋白表达 将终浓度分别为1、2μmol/L的TST作用HNE－1细胞48h后，细胞裂解液提取胞浆蛋白，Bradford法测定含量后，取等质量的蛋白进行SDS－PAGE电泳分离，转膜（220mA 2h）后封闭1h，加入兔抗人Foxm1、β－actin一抗37℃孵育。洗涤后加入羊抗兔二抗孵育2h，TBST液洗涤膜3次，加入ECL化学发光试剂，曝光，成像。用Quantity one分析软件测定各条带光密度值。

1.3统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件进行分析。计量资料采用s表示，进行多组均数比较的单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1MTT法检测TST对HNE－1细胞的生长抑制作用 通过MTT观察到，TST对HNE－1细胞生长抑制作用明显。经各浓度TST作用48h后，HNE－1细胞的生长抑制率分别在8.31%、17.46%、34.28%、58.68%、87.91%、99.05% （表 1）。由此计算出TST作用于 HNE－1细胞48h的IC50为4.015 μmol/L。根据本结果，本文后续实验均选择浓度为1、2μmol/L的TST药物作用于HNE－1细胞。

表1 TST作用48h后对HNE－1细胞增殖抑制作用的影响（s）

表1 TST作用48h后对HNE－1细胞增殖抑制作用的影响（s）

组别 OD490 抑制率（%）

2.2TST对 HNE－1细胞周期变化的影响 用FCM检测TST作用于HNE－1细胞48h细胞周期的变化显示，经TST处理的两组细胞的G0/G1期细胞百分率（68.49±3.16%）%、（72.31±2.43）%均高于对照组（53.91±5.13）%，且差异有统计学意义（P＜0.05）。结果还显示2μmol/L TST组G0/G1期百分率高于1μmol/L TST组（P＜0.05），见表2。

2.3免疫细胞化学法测定不同浓度TST作用于HNE－1细胞48h的Foxm1蛋白表达量 Foxm1在对照组细胞质内表达明显，不同浓度TST作用于HNE－1细胞48h的Foxm1蛋白表达减少，并且TST浓度越大，Foxm1蛋白表达减少越明显。利用分析测量图像软件Imagepro－Plus5.0进行半定量分析，各浓度TST组的平均光密度值（TST 1μmol/L组：0.207±0.008，TST 2μmol/L组：0.186±0.006）与对照组（0.224±0.008）比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见封3图1。

表2 TST对HNE1细胞周期变化的影响（s，%）

表2 TST对HNE1细胞周期变化的影响（s，%）

a：P＜0.05，与空白对照组比较；b：P＜0.05，与 TST 1μmol/L组比较。

组别 G0～G1 S G2/M 53.01±5.13 26.66±1.04 20.33±1.03 TST 1μmol/L组 68.49±3.16a18.33±1.13a13.18±2.31a TST 2μmol/L组 72.31±2.43ab 14.18±1.21ab 13.51±2.52对照组ab

2.4Western blot检测不同浓度 TST作用于 HNE－1细胞48h的Foxm1蛋白表达 作用48h后对照组和各浓度TST组均可见明显的Foxm1蛋白表达，在经TST处理的细胞上表达尤其明显。将各浓度TST组Foxm1/内参灰度比值（TST 1 μmol/L组：0.831±0.014，TST 2μmol/L组：0.758±0.026），与对照组（0.962±0.016）进行比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图2 Western blot检测不同浓度TST作用于HNE－1细胞48h的Foxm1蛋白表达

3 讨 论

鼻咽癌是中国南方常见的头颈部恶性肿瘤之一，化疗是目前晚期鼻咽癌的主要治疗方案之一，但由于化疗药物毒副作用大，临床应用受到限制［4］。肿瘤的发生、发展是一个多因素协同作用的过程，包括病毒感染、致癌物作用、癌基因激活和抑癌基因失活、细胞凋亡和增殖调节失调等多个因素多个环节［5］。随着肿瘤发生、发展过程中新的肿瘤分子机制的不断阐明，全新的肿瘤治疗策略应运而生。其中靶向治疗是目前肿瘤治疗的研究热点［6］。

Foxm1基因是一种增殖特异性基因，与胚胎发育、衰老、再生和肿瘤等许多病理、生理过程关系密切［7］。目前，有研究发现，Foxm1在肝癌、基底细胞癌、乳腺癌 、肺癌等多种肿瘤中高表达，参与肿瘤的发生、发展［8－12］。Foxm1有望成为一种潜在的全新肿瘤治疗靶点。另有报道，TST可特异性抑制乳腺癌细胞中Foxm1，而达到抑制肿瘤生长的作用［7］。

作者的前期研究发现，Foxm1在人鼻咽癌组织中高表达，并与鼻咽癌的分期及转移程度呈正相关。因此，本研究从细胞角度检测Foxm1在鼻咽癌HNE－1细胞株中的表达；同时检测TST对鼻咽癌HNE－1细胞株增殖抑制的作用及与Foxm1相关的可能机制，结果显示：（1）TST对HNE－1有明显的增殖抑制作用，并且随浓度的增加，增殖抑制作用增强，这与Nicolaou等［13］报道TST对肺癌细胞株具有较强的增殖抑制作用相符。（2）在TST作用后的 HNE－1细胞中，G0/G1期细胞百分率增加，导致HNE－1细胞阻滞在G0/G1期，并且呈剂量依赖性，这与Koo等［2］报道TST阻滞乳腺癌细胞株于G0/G1期是相符的。（3）随TST浓度的增加，Foxm1蛋白表达量的表达逐渐减少；TST对 HNE－1细胞的增殖抑制作用可能是通过抑制Foxm1蛋白表达实现的，这与Bhat等［14］报道相符。

综上所述，TST对人鼻咽癌HNE－1细胞株具有较好的体外增殖抑制作用，其机制可能是通过抑制肿瘤细胞中Foxm1转录因子的蛋白表达实现的。本实验可为Foxm1基因成为肿瘤治疗的新靶点及其特异性抑制剂TST的临床应用提供一定的实验室基础。

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