新生大鼠海马神经元原代培养及膜片钳全细胞记录＊

徐祖才，徐 平，张 骏，雷显泽，徐忠祥，王学峰

（1.重庆医科大学附属第一医院神经内科 400016；2.遵义医学院附属医院神经内科，贵州遵义563003）

原代培养的神经元已经成为神经学科领域的同行们最常用的实验对象之一，因此，神经元的原代培养方法日渐增多。随着神经电生理实验技术的迅速发展，特别是膜片钳技术在神经学科的应用以来，对原代培养的神经元状态要求越来越高，本实验在参照文献［1－4］的培养方法基础上稍作改进，培养出细胞膜上各离子通道功能良好的且适应于膜片钳全细胞记录的海马神经元，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物与主要实验仪器 1d内新生Wistar大鼠购自重庆医科大学实验动物中心；SW－CJ－2FD型超净工作台购自苏净集团安泰公司，细胞培养箱购自美国Thenno Fonna，细胞培养板购自美国Costar，TE2000－U倒置相差显微镜购自日本Nikon；TDZ5－WS多管架自动平衡离心机购于长沙湘仪离心机仪器有限公司，TCS－SP2型激光共聚焦扫描显微镜购自德国Leica，NVSLM1型振动切片机购自英国Campden，电极拉制仪（P－97）购自美国，玻璃微电极管（外径1.0mm）购自南京六合泉实验器材厂，膜片钳系统购自美国Axon。

1.1.2主要试剂 神经基础培养基（Neurobasal media）、B－27、L－谷胺酰胺及特级胎牛血清购自美国Gibco公司。种植液组成：神经基础培养基、2%B－27（体积比）、0.5μmmol/L L－谷胺酰胺及10%胎牛血清；维持液：神经基础培养基、2%B－27（体积比）和0.5μmmol/L L－谷胺酰胺。D－Hanks和多聚－L－赖氨酸购于美国Sigma公司，胰蛋白酶由上海佰奥生物科技有限公司提供，小鼠抗NeuN一抗购自美国 Millipore、兔抗小鼠FITC二抗由北京中杉公司分装，重庆医科大学附属第一医院提供10%水合氯醛。人工脑脊液（Artificial cerebrospinal fluid，ACSF）配方及各成分浓度：NaCL 124mmol/L，KCL 3 mmol/L，CaCL22mmol/L，MgCL22mmol/L，NaH2PO41.23 mmol/L，NaHCO326mmol/L和葡萄糖10mmol/L；电流钳模式下记录动作电位的电极内液配方及各成分浓度：K2SO460 mmol/L，N－甲基－D－葡糖胺（NMG）60mmol/L，4－羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）40mmol/L，MgCl24mmol/L，四乙酸（BAPTA）0.5mmol/L，磷酸肌酸（phosphocreatine）12mmol/L，Na2ATP 2mmol/L 和 Na3GTP 0.2mmol/L；电压钳模式下记录电流的极内液成分和相应浓度：KCL 140mmol/L，MgCL20.5 mmol/L，乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）2mmol/L，HEPES 5 mmol/L，K2ATP 4mmol/L，KOH将pH值调至7.2。

1.2方法

1.2.1海马神经元原代培养 先在盖玻片上涂抹0.1%多聚－L－赖氨酸，在超净台内，经紫外灯照射消毒后，放置在24孔细胞培养板孔内备用。选择1d内的新生Wistar大鼠，迅速剥出全脑，移入0℃D－Hanks液中，分离双侧海马并剪碎。加入0.125%胰蛋白酶（体积相当于脑组织的5倍）并置于5%CO2、37℃细胞培养箱内消化20～30min，后加入相同体积的种植液并维持5min以终止消化。1 000r/min离心5min，弃上清液，加入种植液，使用抛光冷却后的巴氏管轻柔吹打，制成细胞悬液，使用200目筛网过滤，经计数后，以种植液稀释成5×105/mL的细胞悬液，24孔细胞培养板的每孔按1mL悬液进行接种，置入5%CO2、37℃细胞培养箱内培养1d即全液更换维持液培养，后每间隔3d更换一半培养液。

1.2.2免疫荧光技术鉴定神经元 神经元核抗原（Neuronal nuclei，NeuN）是神经元细胞核中的一种特异性蛋白质，被认为是成熟神经元的特异性标记物［5］。神经元培养至第10天时，进行细胞爬片，放置载玻片上，经4%多聚甲醛固定30min后，PBS清洗5min×3次，10%山羊血清封闭液常温下处理30min，后倾去血清，加入小鼠抗NeuN抗体（稀释比例1∶100），置4℃冰箱过夜。次日，取出后常温放置2h，PBS清洗5 min×3次，避光加山羊抗小鼠FITC（稀释比例1∶50），常温2 h后，PBS清洗5min×3次，50%甘油封片备用，择期在激光共聚焦扫描显微镜下拍照。

1.2.3膜片钳全细胞记录 参照文献［6］的方法，将备用的细胞爬片转移入浴槽中，使用输液泵持续向浴槽灌注95%O2＋5%CO2混合气饱和的ACSF，浴槽流出端使用蠕动泵将液体以3～4mL/min恒速泵出，调整输液泵至细胞在液面下1～2 mm为适。P－97微电极拉制仪拉制记录微电极（直径1～2 μm），电极内液使用0.2μm的微孔滤膜滤过后充灌电极，充灌电极内液后入水电阻2～4MΩ。选择表面光滑且透光度好的状态良好的神经元进行实验，封接成功后，抽吸破膜即可形成全细胞记录。在电流钳模式下，记录自发性动作电位（action potential，AP）；在电压钳模式下记录自发性兴奋性突触后电流（spontaneous excitatory postsynaptic current，sEPSC），信号采集分析均由pClamp 9.2软件完成。

2 结 果

2.1海马神经元形态学观察 神经元在1d后更换全液，此时在倒置相差显微镜下观察，神经元贴壁稳定，且背景较干净，部分神经元可见较短突起长出（封2图1A）；3d后，神经元突起明显变长变多，且细胞体轮廓清晰，呈锥形（封2图1B）；至第10天时，神经元形态特征明显，细胞体表面光滑，透光度好，可见细胞周围明显光晕，突起增多增长且细出现分支，从而形成明显的神经网络（封2图1C、D）。

图3 膜片钳全细胞记录

2.2NeuN鉴定海马神经元 NeuN免疫荧光染色，激光共聚焦扫描显微镜下可见神经元细胞核着绿色，细胞质和突起不着色，最终发现本方法所培养的神经元纯度可达100%，见封2图2。

2.3膜片钳全细胞记录 在电流钳模式下，可记录到神经元的偶尔自发性AP，膜电位在－65.2mV左右（图3A）；在电压钳模式下，可以记录到神经元的sEPSC（图3B）。

3 讨 论

海马是整个中枢神经系统对缺血、缺氧、炎症等各种损伤耐受能力最差的部位之一，且所含神经元密度高，非神经元细胞相对较少，因此，海马常常被作为神经元原代培养的首选部位。作者阐述了1d内鼠龄的Wistar大鼠海马神经元的原代培养方法，在培养1d后细胞基本贴壁；3d开始细胞体逐渐丰满，突起开始变长；到达第10天时，神经元已经成熟，细胞体形态特征明显，立体感强，表面光滑，透光度良好，周围光晕明显，突起丰富且细胞与细胞之间形成明显的神经网络结构。通过神经元特异性核抗原NeuN及FITC标记，发现所培养的神经元纯度高。为了检测神经元的电生理特征是否完好，通过膜片钳全细胞记录，发现细胞封接顺利，在电流钳模式下可以记录到偶尔自发性AP，在电压钳模式下可以记录到sEPSC，从而证实了细胞膜以及突触传递功能良好，适合膜片钳技术的应用。

针对神经元原代培养的实验对象选择上，目前除了本实验选择的新生鼠外，还可以选用胎鼠，但由于胎鼠的胎龄不易掌控，并且胎鼠的海马剥离困难且体积偏小，而使得该方法的推广遇到了瓶颈［7］。在培养方法上，有选择普通培养基，外加抑制细胞有丝分裂的药物阿糖胞苷，然而，该药物的使用量较难控制，过量时，在抑制胶质细胞的繁殖和生长的同时，对神经元的正常生长也有一定的毒副作用，从而影响其活性，达不到实验需求，量不够时，则不能很好地抑制胶质细胞的增殖［8］。本实验直接选用神经基础培养基及B－27添加剂，能够抑制非神经元的生长而更有利于神经元的生长，从而可以提高神经元的纯度，此外，该组合的培养基中含有多种抗氧化剂，具有保护神经元的作用，从而保证神经元的最终活性［9］。

随着神经学科的快速发展，海马神经元及膜片钳技术有机结合在神经生理功能及病理状态的应用方兴未艾，如兴奋性氨基酸神经毒性［10］、缺氧性损伤［11］、癫痫［12－14］和单纯疱疹病毒性脑炎［15］等。本实验所提供的海马神经元原代培养方法，可为膜片钳技术的顺利应用打下良好的基础。

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