冬虫夏草经肿瘤滋养动脉插管注入对兔VX2肝癌模型的疗效研究＊

罗小平，刘 曦，曹闻挺，邓 昊

（重庆医科大学附属第二医院放射介入中心 400010）

经导管动脉化疗栓塞术（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）作为肝癌非外科手段被国内外广泛采用，目前为非外科治疗的首选方法［1－2］，因药物疗效、肝癌的生物学特性等原因，TACE疗效总难尽人意，改进其技术方法、获取最有效药物是TACE研究的重点。冬虫夏草被广泛应用于免疫、心血管、呼吸、泌尿生殖、消化、神经系统疾病的治疗而备受关注；文献报道，其对人乳腺癌、Balb－c裸鼠非小细胞肺癌、小鼠H22肝癌等具有明显抑制作用［3－5］，可使肿瘤细胞凋亡，同时具有明显促进急性肝功能损害的恢复［6］，本实验拟通过兔VX2肝癌模型的肿瘤滋养动脉内灌注冬虫夏草提取物以研究其治疗价值。

1 方 法

1.1研究对象 新西兰大白兔40只（重庆医科大学动物实验中心），许可证号：SCXK（渝）2007－0001。体质量2.5～3.0kg，雌雄不限。VX2肿瘤细胞珠（重庆医科大学生物工程系），速眠新（沈阳军事医学科学院）。本研究严格遵守动物实验的各项伦理条例。按照文献［7］的方法建立兔VX2肝癌模型。

1.2设备与器材 设备器材包括美国GE公司LightSpeed 16层螺旋 CT；日本岛津1250MA DIGTEX PREMIER VC X线机；日本泰尔茂公司4Fcobra导管、4F导管鞘、2.7FPE导管及20G动脉穿刺针。天然冬虫夏草（重庆医药公司中药材商店购）；超液态碘油（法国Guerbet）。

1.3实验动物分组 40只经CT扫描证肿瘤移植成功的VX2兔，按成组设计法随机平分为4组，以肝动脉内注入物不同分为A组（超液态碘油），B组（冬虫夏草提取液），C组（冬虫夏草提取液＋超液态碘油），D组（生理盐水）。

1.4介入方法及术后处理

1.4.1虫草提取液的制备 10g天然虫草粉碎后以90～95℃蒸馏水50mL提取3h，过滤、减压浓缩至约1/3量，再以90～95℃杀菌30min，－38℃冷冻干燥得提取物，高效液相色谱法测定浓缩液中腺苷浓度，浓度为1 375.7μg/L，超过《中国药典》中对于虫草的质量控制标准。用生理盐水配制成相应浓度，NaOH 调节pH 值为7.2～7.4［8］。

1.4.2实验方法 以速眠新0.5mg/kg肌内注射行麻醉，剑突下纵行切开腹壁约2.5cm并暴露肝脏，分别以约2mm×2 mm×2mm VX2瘤组织1粒（取自荷瘤兔）埋入肝中叶约3 mm深处移植2个病灶，间隔约2cm，2周后行CT平扫及增强，参数为120kV，200mA，FOV 7.5cm×7.5cm，层厚5 mm；碘海醇以0.8mL/s、总量8mL注入。

以5%硫化钠液体于右腹股沟脱毛，速眠新0.5mg/kg肌内注射麻醉，仰卧固定于自制木板；右侧腹股沟区消毒、铺巾，于股动脉搏动最强处纵行切开皮肤约3mm，以血管钳钝性游离股血管鞘，直视下以20G穿刺针与体表成角约15～20°沿髂动脉走行方向穿刺股动脉，将0.021英寸超滑微导丝经穿刺针插入股动脉并达上腹区，沿导丝插入4F导管鞘，经鞘以4F Cobra导管插至腹主动脉上部前壁并插入腹腔干动脉后行DSA检查；依据DSA显示作引导，以2.7FPE微导管行同轴插管越过胃动脉等至肿瘤滋养动脉后再行DSA检查证实［4］；经微导管分别注入超液态碘油（0.5mL）、冬虫夏草提取液（0.5mL）、冬虫夏草提取液（0.5mL）＋超液态碘油（0.5mL）混悬液、生理盐水（0.5mL），并用0.5mL生理盐水冲洗微导管以保证药物全部进入肿瘤血管；以明胶海绵条块填塞穿刺点周围后拔管并压迫止血约15min，缝合、包扎切口；以庆大霉素4万U及青霉素80万U肌内注射（1次/天，连续3d），单笼饲养、加强清洁等护理。仅将术后生存满7d并获得病理标本者成组。

1.5肿瘤增长率检测 实施介入后7d按上述方法再分别行CT扫描，计算肿瘤体积V2，并计算肿瘤增长率＝（V2－V1）/V1%。测量肿瘤最大直径d1及与之成垂直方向的最小直径d2，利用公式V1＝d1×d22/2计算肿瘤体积V1。

1.6病理学检测 实验后7d行CT检查并处死实验兔，取肿瘤及周围0.5cm×0.5cm×0.5cm肝组织，以10%甲醛固定、石蜡包埋、5μm连续切片，行HE染色，以200倍光学显微镜观察，重点为细胞坏死、细胞核碎裂。

1.7统计学处理 应用SPSS17.0软件进行统计学分析，各实验组间的比较用单因素方差分析，多组的两两间比较用LSD法检验，两组间比较用成组t检验，对方差不齐者用秩和检验，血管内皮生长因子（VEGF）表达与微血管密度（MVD）值比较采用双变量相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1实验兔结果 本研究共实施兔肝VX2肿瘤移植51只，术中无死亡，移植后14d内因感染等因素死亡11只，进行实验研究者40只。

2.2CT及DSA检查结果 介入治疗前CT表现：平扫见肿瘤病灶呈类圆形低密度结节影，边界欠清晰，密度较均匀，中心见更低密度区；增强示病灶动脉期边缘环状强化、中心区无强化35只（图1A），病灶全部强化5只；门脉期、延迟期病灶无强化、边缘清晰。肝动脉DSA表现：肿瘤周边血管增粗、扭曲、紊乱，病变中心血管相对较少；1支及1支以上肿瘤滋养动脉分别为14、26只，A、B、C、D组均成功进行超选择性插管（图1B、C）。术后7dCT表现：A组18个病灶，C组20个病灶区周边大量碘油沉积、中心碘油沉积较少（图1D）；术后各组病灶体积、肝内及腹腔内转移、腹水等表现见表1。

表1 术后7d病灶大体病理结果（n）

2.3肿瘤增长率比较结果 实验前A、B、C、D组肿瘤体积分别为（387.5±157.3）、（401.1±164.9）、（375.1±154.3）、（375.1±184.0）mm3，各组比较差异无统计学意义（F＝0.255，P＝0.855）；实验后各组肿瘤体积分别为（922.6±32.9）、（685.8±97.9）、（352.5±171.8）、（1 403.5±409.2）mm3，各组比较差异有统计学意义（F＝26.13，P＝0.030）。4组肿瘤增长倍数分别为1.9、0.85、－0.05、2.6倍。

表2 术后各个肿瘤坏死结果（n）

图1 实验兔病灶CT及DSA表现

2.4病理结果 所有获取的病理组织采用HE染色、200倍光镜观察：介入治疗前可见癌细胞大小、形态不一，排列紊乱，细胞核大，深染，核浆比例增大，呈浸润型生长，肿瘤中心可见黄白色凝固性坏死。介入治疗组术后肿瘤大部分呈凝固性坏死，边缘成熟血管萎缩、闭塞、消失，残留少许不成熟的血管内皮细胞。A组见部分细胞核碎裂，细胞结构基本完整，细胞间界限清晰（封2图2A）。B组多数肿瘤细胞核碎裂、体积缩小，细胞间界限模糊、间隙加大提示肿瘤细胞部分坏死（封2图2B）。C组细胞体积明显缩小、细胞核碎裂、分界模糊，细胞大体结构不能分辨，细胞间间隙明显增加提示细胞基本坏死（封2图2C）。D组肿瘤细胞整体完整，细胞核结构、边界清晰，未见坏死征象（封2图2D）。术后病灶显微病理改变见表2。

3 讨 论

VX2肿瘤为Shope病毒注入兔皮内诱发的鳞癌，通过反复传代后成为兔可移植性肿瘤，在肝脏移植成功率高，其生长、浸润、转移等生物学特性相似人类原发性肝癌，因此，兔VX2肝癌模型被广泛作为肝癌药物、新技术研究的经典实验模型［5］。

在经兔肝动脉插管实验研究时，因肝动脉细小、迂曲，4F导管仅能插管至腹腔干动脉，无法插入细小的肿瘤滋养动脉注入药物，致使实验不准确、实验兔死亡率高；文献显示众多实验研究采用剖腹肝动脉插管或经股动脉穿刺肝固有动脉注入药物［6－7］，而本研究均采用2.7FPE超滑微导管超选择性行病变滋养动脉插管注入药物，使药物更为准确注入病变区、且减少甚至避免非肿瘤肝组织损害（图1B、C），这与目前临床原发性肝癌TACE治疗普遍主张采用超选择性插管栓塞相一致［8－9］，本实验研究发现采用该技术方法后实验兔意外死亡率较低。

国内外学者实验研究显示冬虫夏草除可提高机体免疫机能外，其对乳腺癌、肺癌、前列腺癌等均有明显治疗作用［3，10－12］，以其治疗肝癌，尤其是经肝癌肿瘤滋养动脉直接注入的治疗作用研究较少报道，原发性肝癌病灶均主要接受肝动脉供血且为富血供肿瘤为学术界所公认［13］，本课题以其提取液经肿瘤滋养动脉注入可明显提高肿瘤局部药物浓度增强疗效。

本研究显示，单纯冬虫夏草提取液即可以明显抑制肿瘤病灶生长、生长减慢，促使肿瘤细胞坏死、肿瘤局部滋养动脉减少（图2A），同时降低肿瘤肝内及腹腔转移发生概率，其作用机制尚不清楚，研究结果表明冬虫夏草可以抑制肿瘤生长、转移，明显提高实验兔的存活率，不仅与其抑制肿瘤生长有关，张小强等［14］研究表明其对肝急性化学性损伤具有保护作用，也可能同时具有保护肝功能进而提高实验兔生存率密切相关。

徐辉等［15］报道，肝癌在TACE术后血管内皮生长因子（VEGF）等血管生长因子可促使血管新生，进而促使残存肿瘤快速生长、转移，本实验显示冬虫夏草除促使肿瘤坏死、缩小之外，术后局部肿瘤滋养动脉有减少、甚至有闭塞改变（表2），因此，其可能具有抑制肿瘤血管新生的作用，有待在进一步的实验研究中予以证实。

实验显示冬虫夏草提取液混合碘油后，对于抑制肿瘤生长、转移，以及提高生存率方面明显优于单纯提取液组（图2A、B），这和其与混合碘油后，冬虫夏草抗肿瘤成分高浓度、长时间作用于肿瘤组织密切相关。临床肝癌TACE治疗中，碘油与化疗药物混合可显著提高治疗局部肝癌的疗效，也间接证实了C组疗效优于B组的结果（图2）。

研究同时显示，单纯碘油注入肿瘤滋养动脉后，虽然部分病例未增大，但肿瘤血管无减少、闭塞表现，这与碘油进入肿瘤滋养动脉后，其细小油珠进入肿瘤毛细血管床，可以减少肿瘤血液供应，继而部分抑制肿瘤生长，但其并不能使局部肿瘤明显坏死。

综上所述，冬虫夏草经肿瘤滋养动脉注入对兔VX2肝癌模型的肿瘤组织生长有抑制作用，能明显减少肿瘤肝内及远处转移的发生率，抑制局部肿瘤滋养血管的生长，尤其是与碘油混合后，因局部长时间高浓度的药物作用可以明显提高治疗效果，对于该结果是否适于人类肝癌治疗，有待进一步研究证实。

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