凋亡相关基因Survivin在非小细胞肺癌中的表达及意义

张晓燕 蒋军广 翟展艺 郑元元 刘瑞芬 张婧雯 杨 超 孙 曼

(郑州大学第一附属医院 河南省呼吸疾病研究所 河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室，河南 郑州 450052)

肺癌是当前发病率和死亡率极高的恶性肿瘤之一，在老年人群中高发。多项研究表明肺癌的发生不仅与原癌基因的激活、抑癌基因的失活导致细胞增生过度和分化异常有关，还与细胞凋亡异常有关。生存蛋白(Survivin)是凋亡抑制基因，在肺癌的发生、发展中可能发挥重要作用。本实验探讨Survivin的临床生物学意义及在非小细胞性肺癌(NSCLC)的发病机制中的作用，以期为NSCLC的早期诊断、治疗和预后评估提供实验依据。

1 对象与方法

1.1 一般资料 2008年1月至2009年11月在我院胸外科手术切除且病理证实为NSCLC的肺癌组织标本60例，男35例，女25例，年龄30～78〔平均(54±22.5)〕岁。鳞癌22例，腺癌38例，按组织学分级:高分化10例、中分化30例、低分化20例;按照2002年美国联合癌症分类委员会和国际抗癌联盟制定的TNM分期标准:Ⅰ期17例、Ⅱ期19例、Ⅲ期18例、Ⅳ期6例;伴淋巴结转移27例，不伴淋巴结转移33例;病理学或影像学检查有胸膜转移26例，无转移34例。所有入选的肺癌病人术前均未接受任何抗肿瘤治疗。取20例NSCLC癌旁正常肺组织(距肿瘤边缘大于3 cm并经病理切片证实为正常的肺组织)作为对照。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂 末端转移酶标记技术(TUNEL)凋亡试剂盒购于美国Promega公司，植物过氧化物酶(POD)转换剂购自美国罗氏公司，兔抗人Survivin单克隆抗体、生物素-链霉亲合素复合物(S-P)免疫组化试剂盒及二氨基联苯胺(DAB)显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2.2 免疫组化染色 采用S-P法，主要步骤:石蜡切片脱蜡水化，于柠檬酸缓冲液中行微波抗原修复，双氧水阻断内源性过氧化物酶活性，非免疫性动物血清封闭山羊血清阻断非特异性反应，滴加一抗兔抗人Survivin单克隆抗体，滴加生物素标记的二抗，滴加S-P制剂，DAB显色后自来水充分冲洗，苏木素复染，稀盐酸分化，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察。

1.2.3 细胞凋亡的检测 采用TUNEL法，主要步骤:石蜡切片脱蜡水化，4%多聚甲醛固定，1∶500蛋白酶K工作液通透组织切片，4%多聚甲醛后固定，缓冲液平衡切片，加入孵育缓冲液标记DNA断裂链，载玻片浸入2倍柠檬酸缓冲液(SSC)终止反应，荧光显微镜下分析样品，加入POD转换剂转换，DAB显色后自来水充分冲洗，苏木素复染，稀盐酸分化，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察。

1.2.4 Survivin阳性结果判定及凋亡指数(AI)的计算 在200倍视野下，随机选取5个有阳性细胞存在的视野进行计数，每个视野计数100个细胞，共500个细胞。Survivin以胞质/胞核内出现棕黄色颗粒为阳性细胞。判定方法:(1)按阳性细胞所占百分数评分:0分:0%，1分:＜10%，2分:10% ～50%，3分:＞50%。(2)按细胞染色深浅评分:无棕黄色颗粒，与背景无区别为0分;有棕黄色颗粒，明显高于背景底色为1分;有染色较清晰的棕黄色颗粒，介于强弱之间为2分;有大量的深棕色颗粒，染色强为3分。综合染色强度和阳性细胞所占百分数进行判定，即(1)+(2):最后得分≥4分为阳性表达(+)，＜4分为阴性表达(-)。在40×10高倍视野下随机选取10个视野观察，计算凋亡细胞与所计数细胞总数的比值，即AI=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.3 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行分析，数据资料以x±s表示，采用χ2检验的连续性校正及直线相关分析。

2 结果

2.1 Survivin在NSCLC中的表达及与临床病理特征的关系Survivin主要定位于胞质或胞核。60例NSCLC组织中Survivin的阳性表达率为46.7%(28/60)，20例正常肺组织的阳性表达率为10.0%(2/20)，两者比较差异有统计学意义(χ2=8.604，P=0.003)。Survivin在NSCLC患者高分化组中的阳性表达率低于中、低分化组，Survivin在临床分期Ⅰ和Ⅱ期的阳性表达率低于Ⅲ和Ⅳ期，有淋巴结转移的NSCLC患者中的阳性表达率高于无淋巴结转移者;而与NSCLC患者的年龄、性别、肿瘤直径、病理分型、是否吸烟及有无胸膜转移无关。见表1。

2.2 Survivin与细胞凋亡之间的关系 Survivin分值0分、1～2分、3～4分、5～6分者 AI分别为4.49±1.60，3.78±1.53，2.58±0.88，1.45±0.46。可见，Survivin积分与 AI呈负相关(r=-0.736，P=0.000)。

表1 Survivin在NSCLC组织中的表达及其与临床病理特征的关系〔n(%)〕

3 讨论

Survivin是凋亡抑制蛋白家族(IAP)中的成员，在胚胎、胎儿组织中显著表达在终末分化的成人组织如肝、肺、脑、脾、胰、肾、心脏、外周血白细胞、淋巴结及骨骼肌中则不表达(胸腺和生殖腺除外)〔1〕。随着对该基因更深入的研究，人们发现在人类多种肿瘤细胞中有Survivin的表达。Survivin抗凋亡的机制有以下几种观点:(1)通过直接抑制终末效应蛋白半胱氨酸蛋白酶(caspase-3)和caspase-7，抑制caspase的活化和凋亡，从而抑制细胞凋亡〔2〕。(2)与辅助性线粒体源性caspase线粒体激活因子(SMAC)结合，进而对抗甚至抑制caspase活性;同时，还可保护IAP的其他成员，如X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)免受SMAC的抑制而维持抗凋亡功能〔3〕。(3)间接作用于细胞周期依赖激酶4(CDK4)，形成Survivin/CDK4复合物，引起p21的释放，p21作用于 caspase-3前体，形成 procaspase-3/p21复合物，该复合物抑制了procaspase-3的激活，进而抑制了细胞的凋亡〔4〕。(4)与有丝分裂初期纺锤体的微管结合，间接抑制凋亡效应因子caspase对纺锤体的水解，抑制细胞凋亡〔5〕。(5)通过非caspase依赖的细胞凋亡途径实现，如参与调节p53依赖的凋亡〔6〕。本实验结果显示，Survivin在胞质、胞核着色或胞质/胞核同时着色，偶见胞膜着色。在NSCLC中的表达明显高于正常肺组织，提示Survivin的异常表达在NSCLC的发生、发展中起到一定作用。Survivin有可能成为一种肿瘤标记物，为肺癌的早期诊断提供实验依据。

刘江伟等〔7〕报道，在胰腺癌中Survivin的阳性表达与病理学分级相关。Lu等〔8〕研究发现Survivin的表达与胃癌的分化程度有关。本实验提示Survivin的表达有更高的恶性生物学意义，检测Survivin有助于NSCLC恶性程度的判断，Survivin阳性表达率越高，NSCLC恶性程度越高。Survivin在NSCLC临床分期Ⅰ和Ⅱ期的阳性表达率低于Ⅲ和Ⅳ期，与刘红菊等〔9〕报道的结果一致，检测Survivin可能有助于临床TNM分期。TNM分期作为一种临床分期的标准，对肿瘤预后的判断有相当重要的价值，TNM分期愈晚，预示着肿瘤侵袭性愈高和预后不良，因此检测Survivin可能有助于NSCLC预后的判断。本研究发现Survivin在NSCLC组织中的表达与有无淋巴结转移有关，与张晓宇等〔10〕的研究一致。因此，检测Survivin的表达可能有助于有无淋巴结转移的判断。

本实验表明Survivin积分与AI呈负相关。因此可以推论，Survivin在组织中的高表达抑制了突变的、多余的细胞发生凋亡，促进了肿瘤的生长。但Survivin能否成为诊断NSCLC的肿瘤标记物及判断预后的有效指标，还有待于更多的研究证实。

1 鲍晓蕾.凋亡相关基因PDCD5、Survivin在胃癌组织的表达及临床意义〔D〕.吉林大学硕士学位论文，2007.

2 Ambrosini G，Adida C，Alteri DC.A novel anti-apoptosis gene，surviving，expressed in cancer and lymphoma〔J〕.Nature Med，1997;3(8):917-21.

3 Verhagen AM，Ekort PG，Pakusch M，et al.Identification of DIABLO，a mammalian protein that promotes apoptosis by binding to and antagonizing IAP proteins〔J〕.Cell，2002;102(1):43-53.

4 Suzuki A，Ito T，Kawano H，et al.Survivin initiates procaspase 3/p21 complex formation as a result of interaction with CDK4 to resist Fas-mediated cell death〔J〕.Oncogene，2000;19(10):1346-53.

5 Deveraux QL，Takahashi R，Salvesen GS，et al.X-linked IAP is a direct inhibitor of cell death proteases〔J〕.Nature，1997;388(6639):300-4.

6 Mirza A，McGuirk M，Hockenberry TN，et al.Human survivin is negatively regulated by wild-type p53 and participates in p53-dependent apoptotic pathway〔J〕.Oncogene，2002;21(17):2613-22.

7 刘江伟，李开宗，窦科峰.Survivin在胰腺癌组织中的表达及其与p53的相关性研究〔J〕.西北国防医学杂志，2003;24(6):417-9.

8 Lu CD，Altieri DC，Tanigawa N.Expression of a novel antiapoptosis gene，survivin，correlated with tumour cell apoptosis and p53 accumulation in gastric carcinomas〔J〕.Cancer Res，1998;58(9):1808-12.

9 刘红菊，陶晓南，白 明，等.凋亡抑制基因survivin、bcl-2、bax在肺癌中表达的研究〔J〕.中国实用内科杂志，2007;27(10):767-9.

10 张晓宇，钟立厚，胡 克，等.生存素在非小细胞肺癌中的表达及与细胞凋亡的关系〔J〕.中国肺癌杂志，2004;7(2):138-41.