微量元素钴对脆杆藻和斜生栅藻增殖的影响

张玮玮，王家官

（1.山西生物应用职业技术学院，山西太原 030031；2.山西省农业厅农垦局，山西太原 030031）

钴（Co）属铁族元素，为顺磁性银白色金属。半个世纪以来，钴的研究取得了很大进展，迄今为止，已证实钴元素是人体、动物、藻类、微生物及豆科作物等所必需的微量营养元素[1-2]，是植物生长的有益元素，对多种农作物有增产作用[3]。大量研究表明，钴及其化合物具有一定的生物学效应和药理作用。在高等植物中，钴可以提高叶片叶绿素含量，增强植株的光合作用，对多种作物有增产作用。钴参与机体酶的组成以及对酶具有活化作用，可治疗多种贫血；钴盐对低色素小细胞性贫血的疗效较好；钴参与构造维生素B12的特定结构，对高色素巨细胞性贫血疗效显著，因而，钴的研究引起了人们的重视[4-5]。目前，在藻类中也开展了一些工作，崔青曼等[6]试验表明，低浓度的钴对小球藻、极大螺旋藻的生长具有明显的促进作用。重金属对藻类生物的影响主要体现在2个方面：一方面是重金属对藻类的致毒效应，另一方面是重金属可提高藻类的新陈代谢过程，促进生长[7]。比较重要的微量金属有Fe，Mn，Cu，Mg，Mo，Co等，其主要机理是作为辅助因子参与生物生化反应，以促进生物增殖。在对汾河水库水体监测的过程中发现，钴浓度的变化与硅藻、绿藻的消长有一定的相关性。

本试验采用藻类增长潜力试验（AGP）探讨了钴对脆杆藻（硅藻）和斜生栅藻（绿藻）细胞增殖的影响，以期从微量元素角度探讨汾河水库浮游藻类细胞密度上升较快的原因,为防治水体富营养化提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本试验所用的藻种是脆杆藻（Fragilariasp.Fachb-218）和斜生栅藻（Scenedesmus obiquus）。

1.2 试验方法

1.2.1 藻种的驯化与培养 将藻种在MGC－300B型微电脑控制光照培养箱中进行无菌驯化培养。斜生栅藻选用BG11培养基，脆杆藻选用D1培养基。培养条件为：光照强度2 000 lx，光暗比14 h∶10 h。经过14～21 d的驯化培养，藻种可达到试验要求。

1.2.2 Co2+质量浓度梯度的培养基配制 用Co（NO3）2·6H2O配置系列 Co2+质量浓度梯度的培养基，如表1所示。

表1 培养基中Co2＋的质量浓度梯度

1.2.3 接种 用722S分光光度计测出斜生栅藻与脆杆藻藻种液的细胞光密度值为0.1～0.2时，进行接种。取50 mL藻种液，在3 500 r/min下离心10 min，弃上清液。沉淀的藻细胞用0.001 5%碳酸氢钠水溶液重新悬浮，再离心，以除去营养物及其他物质。这样的洗涤过程进行2次，最后用碳酸氢钠水溶液再悬浮（碳酸氢钠液的体积根据已计算出的用于接种时所需要的藻种液的细胞密度来确定）。接种完毕，锥形瓶用透气膜封盖，在设定条件下进行培养。

1.2.4 试验条件 斜生栅藻培养温度（25±1）℃，脆杆藻培养温度（22±1）℃，光照强度为2 000 lx，光暗比14 h∶1 0 h。为减少因光照不均匀可能造成的影响，每隔2～3 h摇动并更换各试验组锥形瓶的位置1次。保持试验液pH值≤8.5。

1.2.5 光密度（OD）值与叶绿素 a（Chla）的测定

培养液中藻细胞密度能决定其光密度（OD）的大小和叶绿素a（Chla）含量的高低。本试验通过测定试验液中OD和Chla的数值来说明2种藻的细胞密度消长状况。

OD值的测定：先用紫外分光光度计测定斜生栅藻和脆杆藻的全吸收波谱，确定它们的吸收峰，然后将试验液在722S可见分光光度计上测定OD值。斜生栅藻和脆杆藻测定750 nm（吸收峰）处的OD值。从试验第2天开始，每隔1 d测定1次，直到试验结束，每次测定的时间基本相同。

叶绿素a的测定：采用甲醇萃取法。取3 mL试验藻液在3 500 r/min下离心10 min，弃去上清液，然后等体积加入90%（V/V）无水甲醇，混匀，放置在4℃黑暗条件下萃取6～8 h，离心，取上清液，在722S可见分光光度计上测定665 nm处光密度值。根据公式C（μg/mL）＝OD665×13.9，计算出叶绿素a的含量。

2 结果与分析

2.1 钴对脆杆藻增殖的影响

2.1.1 不同质量浓度（A～E）Co2+对脆杆藻OD值的影响 试验结果（图1）显示，在试验的前4 d，脆杆藻处于增殖的调整期，从第7天开始，A，B，C，D组的该藻细胞均不同程度进入分裂增殖对数期，B，C组增长幅度较大，并一直呈上升趋势，而D，E组虽也增长但趋势比较缓慢，直到第8天后，开始有缓慢增殖。试验结果还显示，当Co2+质量浓度在0.120 0～0.167 8 μg/L之间时，脆杆藻增殖比较明显；当Co2+质量浓度达到0.284 9 μg/L时，该藻的增殖受到很大抑制，至第12天细胞分裂基本停止。

由B组与D组细胞吸光值的t检验结果得出，B组与D组之间存在显著性差异（P＜0.05）。此检验说明，在氮磷营养盐等条件适宜的情况下，低质量浓度的钴对脆杆藻藻细胞的增殖有明显的促进作用。

2.1.2 不同质量浓度（A～E）Co2+对脆杆藻叶绿素a含量的影响 叶绿素a的含量能反映出不同钴质量浓度下脆杆藻细胞的增殖状况。从图2可以看出，Co2+质量浓度为0.120 0 μg/L时（B组），叶绿素a含量增长较快；Co2+质量浓度在0.229 1～0.284 9 μg/L之间时，叶绿素a含量增长受到抑制。

从图2可以看出，脆杆藻叶绿素含量的变化与OD值变化趋势基本一致，呈正相关。图1显示，A组在接种7 d后细胞分裂进入对数期，但增长幅度较小，到第10天达到最大值，以后呈下降趋势。其变化趋势与B组、C组类似。图2显示，A组与B组、C组的变化趋势基本一致。A组的这种变化趋势的原因可能是脆杆藻对钴元素的需要极其微量，在接种之前藻细胞中已含有的钴元素维持了它前期细胞增殖的需要，随着钴元素消耗，细胞密度明显下降（图1）。

2.2 钴对斜生栅藻增殖的影响

2.2.1 不同质量浓度（A～G）Co2+对斜生栅藻光密度值的影响 试验结果（图3）显示，在试验的前4 d，斜生栅藻处于增殖的调整期，从第5天开始，各试验组的该藻细胞均不同程度进入分裂增殖对数期，B，C，D组增长幅度较大，并一直呈上升趋势，而E，F，G组增长趋势比较缓慢，尤其G组到12 d后细胞分裂基本停止。试验结果还显示，当Co2+质量浓度在0.120 0～0.229 1 μg/L之间时，斜生栅藻的增殖比较明显；当Co2+质量浓度达到0.328 1 μg/L时，该藻的增殖受到抑制，接种后至第10天细胞分裂缓慢。当Co2+质量浓度达到0.328 1 μg/L以上时，该藻生长繁殖基本停止。

C组与E组细胞吸光值的t检验结果显示，C组与E组之间有显著性差异（P＜0.05）。C组钴的质量浓度为0.167 8 μg/L，E组钴的质量浓度为0.284 9 μg/L。此检验说明，在氮磷营养盐等条件适宜的情况下，低质量浓度的钴对斜生栅藻藻细胞的增值有明显的促进作用。

2.2.2 不同质量浓度（A～G）Co2+对斜生栅藻叶绿素a含量的影响 叶绿素a的含量能反映出不同钴质量浓度下斜生栅藻细胞的增殖状况。结果显示，Co2+质量浓度为 0.167 8 μg/L时（C组），叶绿素a含量增长较快；Co2+质量浓度在0.284 9～0.350 0 μg/L之间时，叶绿素a含量增长受到抑制。

从图3，图4可以看出，A组与B组、C组的变化趋势基本一致。由此可以得出，斜生栅藻与脆杆藻一样，对于钴元素含量的要求都非常低。

2.3 汾河水库中钴的含量及其与浮游藻类密度的关系

汾河水库位于山西省太原市西北娄烦县境内，下静游村至下石家庄之间引黄入晋工程实施后，汾河水库作为黄河水的调蓄水库，担负起省城340万人的饮水供应任务，成为省城最主要的水源地。自1961年建成后，其水质良好，一直保持在国家地表水环境质量Ⅱ类水标准（GB 3838—88）。但是1999年以来，由于我国华北地区连续干旱和上游用水量增加等原因，使库区蓄水量急剧减少，环境容量迅速萎缩，加之面源、点源和内源的污染，使库区水体中浮游藻类的密度上升较快。初步调查显示，除了上述原因造成库区水体中以N，P为主的营养盐含量增长以外，微量元素也起着一定作用。

2010年4月、9月与2011年5月、9月对汾河水库8个断面的微量元素进行检测，钴的含量在不同的时间段变化趋势不同，其结果如图5所示。

从图5可以看出，2010年4月和2011年5月这2个月份中Co2+的含量比较高；而2010年9月和2011年9月Co2+的含量却相对较低。汾河水库浮游藻类密度随着季节的变化而改变，在相应的时间内硅藻、绿藻和蓝藻的密度变化如图6所示。

在库区水体物理、化学指标一定的前提下，从图5，6可以看出，水体中钴的质量浓度同浮游藻类中硅藻、绿藻的生长有一定的相关性，即当钴的含量较高时，硅藻、绿藻的细胞密度相应较少，同时由于4，5月光照弱、水温低，不利于藻类的生长，所以，藻细胞密度较少；反之，当钴的含量较低时，硅藻、绿藻的细胞密度会相应增加，同时由于9月光照强、水温高，有利于藻类的生长，所以，藻细胞密度较多。而对于蓝藻来说，钴的含量多少对其生长影响没有规律性。这一结论与AGP试验结果刚好吻合。这表明，低质量浓度的钴常具有促进藻类生长的作用，而高质量浓度的钴则有抑制作用，严重时会产生毒害作用。

3 结论与讨论

钴是藻类许多生理过程中起重要作用的微量元素，在适当的浓度下可促进许多酶的活性。草酰乙酸脱羧酶是一种催化CO2分子从草酰乙酸上脱落下来的酶，Co2+的质量浓度对该酶的活性有很大的影响，低质量浓度时，酶的活性较高，而高质量浓度时酶的活性会受到很大程度的抑制。钴离子能使核酸解聚，结合在磷酸酯基上的金属离子可从RNA和多核酸的磷酸二酯链上夺取电子，从而使得成键不稳定和易水解，这样生物大分子可降解成小碎片，从而使生物机体发生病变[7-8]。锰、镍等也可促使这种降解作用。一般情况下，重金属对藻类的致毒效应主要表现在：影响藻类的生长代谢、抑制光合作用、减少细胞色素，导致细胞畸变[9-10]。

无论是在人工培养液还是天然水体中，重金属的种类与数量都不可能是单一的、固定不变的，各种水生生物，包括藻类，常受到多种重金属联合作用的综合影响。重金属彼此间的相互作用有拮抗、协同、相加和致敏4种，已查明，许多成对的元素在生物学上表现出拮抗效应[11]，常见的有：Hg－Cu，Cd－Zn，Fe－Mn，Cu－Co等；有时是2种以上的元素起作用，如：Co－Cu－Mn。在高等植物中，钴可以提高番茄叶片叶绿素含量、增强植株的光合作用，并显著提高番茄的坐果率、单株结果数和产量。

本试验的结果显示，脆杆藻和斜生栅藻在不同的钴质量浓度下增长的情况不同，在质量浓度较低时，影响藻类的生长代谢；在适宜的质量浓度范围内，能增强藻类的光合作用，使藻细胞数量增殖较快；质量浓度较高时，藻细胞数目增殖较慢，原因可能是藻类生长除了受钴的影响外，还受到其他一些因素的影响，如金属间的相互作用等。

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