辣椒枣试管苗叶片再生植株研究

肖 蓉，王国平，李春燕，张拥兵

（山西省农业科学院果树研究所，山西太谷 030815）

枣树全身是宝，是我国重要的经济树种之一。针对枣特有的花蕾小、去雄困难及胚败育严重等特点，利用现代生物技术，加速培育优良枣新品种意义非凡。而在现代生物技术的研究与应用中，离体叶片再生技术是果树细胞水平的诱变育种、变异筛选、嵌合体分离及基因转移等方面的基础[1-2]。因此，对不同基因型的枣品种建立高效稳定的枣叶片再生体系在枣育种中尤为重要。由相关文献报道可知，科研工作者已建立了民勤小枣[3]、梨枣[4]、沾化冬枣[5]、骏枣[6]、鸡心枣[7]等枣品种的叶片再生体系，但还未见关于辣椒枣叶片再生的报道。

本试验在前人研究的基础上，以辣椒枣为试材，对影响其叶片再生的一些因素进行研究，旨在确定辣椒枣叶片再生的最佳条件，建立高效稳定的辣椒枣叶片再生体系。

1 材料和方法

1.1 材料

外植体：辣椒枣试管苗叶片，苗龄35 d，采自山西省农业科学院果树研究所果树生物技术研究室。

培养基：1/2 MS（大）、MS和WPM共3种基本培养基，并附加不同浓度的TDZ，IBA和糖。

1.2 方法

1.2.1试验设计研究选用L9（34）设计，进行4因素3水平的正交试验。查阅相关文献资料，确定基本培养基种类、植物生长调节剂TDZ和IBA、糖4个参试因素，每个因素3水平，研究分析不同因素在不同水平条件下对辣椒枣试管苗叶片再生植株的影响（表1）。

表1 正交试验因素水平

1.2.2 试验方法 剪取辣椒枣试管苗从叶尖往下数的第3，4，5片叶子，在叶上垂直于叶脉方向用手术刀划伤，然后接种于培养基上。每瓶放置6片叶，其中，3片叶片正面接触培养基（反放），另外3片叶片背面接触培养基（正放）。试验共9组培养基，每组培养基分装10瓶，其中，5瓶在温度为（25±2）℃的培养室内先暗培养14 d，再在光照12～16 h/d，光照强度3 000 lx左右，湿度为60%～70%的培养室内培养；另外5瓶则不经过暗培养，直接在光下培养。培养28 d后调查出愈情况和褐化情况，并将外植体转入MS＋IBA 0.1 mg/L＋GA30.05 mg/L培养基内诱导不定芽再生；培养60 d后调查不定芽再生数。试验重复5次。

1.3 数据统计

出愈率＝（分化愈伤叶块数/接入叶块数）×100%；

褐化率＝（褐化叶块数/接入叶块数）×100%；

平均每叶块不定芽再生数＝再生芽总数/接入叶块数。

采用DPS统计软件对数据进行方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同培养方式对叶片再生的影响

观察发现，先暗培养、再光培养处理的叶片在经过14 d的暗培养后，生成的白色愈伤明显多于直接光培养处理的叶片。暗处理的叶片整体颜色发白，而光处理的叶片整体显绿（图1，2）。随着培养时间的延长，白色愈伤逐渐转为淡黄色，经过暗处理的叶片在培养18 d时出现了绿色芽点，没有暗处理的叶片则在培养22 d时才有绿色芽点出现。

在培养28 d后，不同培养方式对叶片愈伤及褐化的影响表现得更明显（表2）。

表2 不同培养方式对辣椒枣叶片再生的影响

从表2可以看出，2种培养方式相比较，无论是正放还是反放，经过暗处理的辣椒枣叶片出愈率均较高，褐化率均较低。从最终的不定芽再生数来看，有暗处理的叶片较没有暗处理的叶片高71%（正放）和78%（反放）。尽管统计分析显示，各处理结果间差异未达到0.05显著水平，但暗处理有利于辣椒枣叶片再生这一点是可以肯定的。

2.2 不同接种方式对叶片再生的影响

表3是暗培养条件下叶片不同接种方式的处理结果。从表3可以看出，辣椒枣叶片正放比反放出愈率高，但差异未达到显著水平。褐化率正放也比反放高，分别为62%和40%。这可能与叶片结构有关。叶片结构具有背面叶肉细胞排列较正面疏松、气孔数量较正面多的特点。因此，叶背面与培养基接触则容易吸收养分，出愈率较高；但所吸收的养分中有些物质又是极易导致褐化的。因此，褐化率正放比反放高，最终导致正放的不定芽再生数低于反放，分别为1.20，1.42个。

另外，在培养过程中观察发现，辣椒枣的愈伤组织先从叶片背面的叶脉长出，叶片反放有利于愈伤组织及芽点的观察。故本试验认为，辣椒枣叶片再生培养时，以叶片反放（即叶片背面朝上）为最好。

表3 不同接种方式对辣椒枣叶片再生的影响

2.3 不同培养基对叶片再生的影响

2.3.1直观分析采用L9（34）正交表进行4因素3水平的正交试验，旨在找出辣椒枣叶片再生的最佳培养基。从表4可直观地看出，第1个组合的不定芽再生数最高，均值达每叶片5.400 2个。最优培养基组合为A1B1C1D1。

周瑞金[8]研究得出，叶片在以MS为基本培养基时，形成愈伤组织较多，不定芽80%是从叶片正面产生；在以WPM为基本培养基时，愈伤组织少，叶片褐化重，但不定芽再生数量多，且不定芽多从叶片背面不经过愈伤组织而直接生成，质量较高。本试验也有相似现象。从表4可以看出，在7，8，9号组合中，叶片大多褐化，出愈率为0，但在7号组合中，叶片最终平均每个叶片长出0.133 2个再生芽。但总的来看，第7，8，9号组合不定芽再生数大多为0，这表明WPM不适合作为辣椒枣叶片再生的基本培养基。

2.3.2 极差分析 表5是不同因素对辣椒枣不定芽再生数影响的极差大小分析。

表4 正交试验结果

由表5可知，调整后的R值排序为RA＞RB＞RD＞RC，则影响不定芽再生数的因素主次顺序为A＞B＞D＞C。根据各因素水平均值的大小，可得不定芽再生数最高的培养基组合为A1B1D1C1。

表5 极差分析结果

2.3.3 方差分析 表6表明，基本培养基对不定芽再生数的影响最大，达到极显著水平（P＜0.01），TDZ和糖浓度对不定芽再生数也影响显著（P＜0.05），而IBA对再生数的影响不显著。由F值的大小得出，影响不定芽再生数的主要因素A＞D＞B＞C。表5中B和D的极差值相差只有0.000 1，综合极差分析和方差分析，在本试验中4个因素对不定芽再生数的影响大小为A＞D＞B＞C。

表6 方差分析结果

2.3.4 多重比较 表7是不同处理因子各水平间的多重比较，结果表明，A因素各水平中，A1相对于A2，A3对辣椒枣叶片不定芽再生数有明显提高，方差分析达极显著水平（P＜0.01），这说明1/2 MS（大）培养基相对于MS培养基和WPM培养基更有利于辣椒枣叶片再生。B，C，D因素各水平中以B1，C1，D1对不定芽再生更有利，但它们在0.01水平上差异均未达显著水平。

表7 不同处理因子各水平间差异显著性检验

综合直观分析、极差分析、方差分析和多重比较的结果，确定辣椒枣组培苗叶片再生的最优培养基为A1D1B1C1，即1/2 MS（大）＋TDZ 0.3 mg/L＋IBA0.1 mg/L＋糖 20 g/L。

3 结论与讨论

辣椒枣叶片再生培养中，适当的暗处理有利于辣椒枣叶片愈伤组织的形成，并能促进愈伤组织尽快形成芽点，有利于缩短叶片再生培养时间。本试验中暗处理时间为14 d，在今后的研究中还有待进一步确定暗处理的最佳时间。

在有关枣的叶片再生研究中，何业华等[9]对来自日本山形县和富山县的普通枣研究发现，暗处理时叶片愈伤率达100%，光照条件下愈伤率仅为10%，叶块枯死率达78%，愈伤组织的质量减少，颜色加深；暗培养条件能促使叶块产生较多的不定根，而在光照条件下，未见不定根的发生。这说明光对日本山形县和富山县的普通枣外植体愈伤组织的形成有阻碍作用，暗处理可以促进愈伤组织的发生。其他研究也发现，暗培养较光照培养有利于民勤小枣愈伤组织的诱导[3]，对防止褐化和促进木枣叶片再生也有显著的效果[10]。

而梁国栋等[11]在诱导骏枣叶片愈伤组织过程中发现，最适于诱导的条件应该是前期光培养后期暗培养；李云等[12]在温度（25±2）℃、光照时间12 h/d、光照强度2 000 lx的条件下，将赞皇大枣叶片培养30 d后，由叶背处诱导出了不定根。2种相反的结果说明，不同基因型的物种在叶片再生时对光的需求不同。因此，必须根据研究试材分别进行探索，才能确定其最佳的叶片培养方式。除了对光的需求不同外，不同基因型物种在叶片再生培养时所需的放置方式也不一样。王慧瑜等[7]发现，鸡心枣试管苗叶片以叶背面接触培养基最易诱导出不定芽；而陈宗礼等[5]则发现，沾化冬枣叶片背面向上的愈伤组织诱导率比向下的约高出36%左右。在本试验中，叶片正放出愈率高，同时褐化率也高；叶片反放便于愈伤组织及芽点的观察，褐化率低，最终的不定芽再生数高于叶片正放，是辣椒枣叶片再生培养中的最佳放置方式。

本试验正交试验结果表明，基本培养基，TDZ，IBA和糖4个因子对辣椒枣叶片再生影响大小排序为：基本培养基＞糖＞TDZ＞IBA。1/2 MS（大）为最优培养基，WPM不适合作为辣椒枣的叶片再生培养基。经直观分析、极差分析、方差分析和多重比较，可以确定辣椒枣组培苗叶片再生的最优培养基为1/2 MS（大）＋TDZ 0.3 mg/L＋IBA0.1 mg/L＋糖20 g/L，其平均每叶片再生不定芽能达到5.4个。

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