宫颈癌cyclin G1表达与临床病理因素关系的研究

翁玉英 林东红 吴荔香 林德馨 成 玲 薛晓光 陈光荣 廖 翏

(福建省妇幼保健院检验科，福州 350001)

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，发病原因目前尚不清楚，国内外大量资料证实，早婚、早育、多产、性生活紊乱以及有人乳头状瘤病毒(Human papilloma virus，HPV)感染的妇女有较高患病率。近年来有研究表明，宫颈癌的发生还与细胞周期蛋白(cyclins)的表达和调控异常密切相关。许多资料显示，在已发现的cyclins(A～I)九个成员中，cyclin B、D、E的表达与宫颈癌密切相关。cyclin G1是一类发现较晚的细胞周期蛋白G的一个亚型，其确切功能尚未完全认识清楚，它与宫颈癌关系的研究也鲜为报道。本课题组之前研究报道了CIN和宫颈癌中cyclin G1蛋白的表达与HPV分子亚型感染情况，结果显示cyclin G1蛋白在宫颈癌中高表达，并与高危型HPV有显著正相关［1］。本实验进一步研究cyclin G1 mRNA和cyclin G1蛋白在CIN和宫颈癌中的表达及其相关性，并分析其与临床病理因素的关系。

1 材料与方法

1．1 研究对象 收集2007年11月到2008年9月经我院病理确诊的福尔马林固定、石蜡包埋标本107例，术前均未放、化疗，具有完整的临床资料和病理资料。其中宫颈癌组46例，患者年龄33～64岁，中位年龄46岁。组织学分级(按WHO标准):Ⅰ/Ⅱ级31例，Ⅲ级15例;临床分期［按照国际妇产科联盟(FIGO，1994)修订的临床分期标准分期］:Ⅰ期20例，≥Ⅱ期26例;局部肿瘤大小:＜4 cm者27例，≥4 cm者19例;间质浸润程度:浸润≤1/2肌层17例，浸润 ＞1/2肌层29例;脉管和(或)宫旁浸润:有浸润25例，无浸润21例;淋巴结转移:有转移13例，无转移33例。CIN组43例，患者年龄31～58岁，中位年龄43岁，包括CINⅠ组21例，CINⅡ/Ⅲ组22例。对照组18例，为因良性病变行子宫全切的正常宫颈组织，患者年龄34～57岁，中位年龄44岁。三组患者年龄差异无统计学意义(P＞0．05)。全部标本均3～4μm厚连续切片，用于HE染色、免疫组化和原位杂交检测，并得到高年资病理医师再次确诊证实。

1．2 试剂 cyclin G1(SC-8016)单克隆抗体购自美国SANTA CRUZ公司;PV-9000免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒等均购自北京中杉生物公司;cyclin G1 mRNA(MK1287-h)原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物公司。

1．3 方法

1．3．1 原位杂交法检测cyclin G1 mRNA的表达3%胃蛋白酶消化5分钟，杂交液42℃杂交过夜，DAB显色，其余原位杂交步骤严格按照试剂盒说明书。以PBS代替杂交液作阴性对照，用已知阳性结肠癌切片作阳性对照。结果判读:cyclin G1 mRNA阳性染色为细胞浆呈棕褐色或棕黄色颗粒，胞核可有少量表达。400倍显微镜下每张载玻片计数1 000个细胞，根据阳性细胞所占百分比进行半定量分析:阳性细胞数＜5%为阴性，即“－”;阳性细胞数≥5%为阳性，其中5% ～25%为“+”，26% ～50%为“++”，＞50%为“+++”。

1．3．2 免疫组化二步法检测cyclin G1蛋白的表达一抗(1∶50稀释)4℃湿盒过夜，抗原高温高压进行修复，DAB显色，其余免疫组化步骤严格按照试剂盒说明书。以PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性结肠癌切片作阳性对照。结果判读:cyclin G1阳性染色为细胞核呈棕褐色或棕黄色颗粒，细胞结构清晰、阳性颗粒定位好、着色与背景对比清楚。阳性细胞所占百分比半定量分析与原位杂交法同。

1．4 统计学分析 采用SPSS13．0统计软件包对数据进行分析。阳性率的比较采用χ2检验或Fisher's确切概率法，表达强度的比较和相关性分析采用Spearman双变量相关检验，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 不同级别宫颈病变组织cyclin G1 mRNA和蛋白的表达情况 cyclin G1 mRNA阳性表达主要定位于细胞质，cyclin G1蛋白阳性表达主要定位于细胞核，两者阳性表达部位均与病变部位基本相符(图分别见图1和参考文献1)。在正常对照组、CINⅠ组、CINⅡ/Ⅲ组和宫颈癌组中，cyclin G1 mRNA和蛋白的阳性表达强度与宫颈病变级别均呈正相关，相关系数和 P值分别为 r=0．378，P=0．000;r=0．487，P=0．000。

图1 原位杂交法检测正常宫颈上皮、CIN和宫颈癌组织的cyclin G1 mRNA表达情况(×400)Fig．1 Expression of cyclin G1 m RNA in norm al cervix tissue，CIN and cervical carcinom a(ISH，DAB staining，×400)

表1 正常对照组、CIN组和宫颈癌组cyclin G1 mRNA和蛋白的表达(n=107)Tab．1 The expressions of cyclin G1 m RNA and cyclin G1 protein in normal cervix tissue，CIN and cervical carcinoma(n=107)

表2 正常对照组、CIN组和宫颈癌组cyclin G1 mRNA与cyclin G1蛋白表达的相关性(n=107)Tab．2 Relation of cyclin G1 protein expression with cyclin G1 m RNA expression in normal cervix tissue，CIN and cervical carcinoma(n=107)

表3 宫颈癌cyclin G1 mRNA、cyclin G1蛋白的表达与临床病理因素的关系(%，n=46)Tab．3 Relations of cyclin G1m RNA expression and cyclin G1 protein expression with clinical pathologic characters in cervical carcinoma(%，n=46)

如表1结果所示，CIN组与宫颈癌组的cyclin G1 mRNA阳性表达率分别为46．5%和60．9%，两者差异无统计学意义(P＞0．05)，但均显著高于正常对照组(11．1%，P ＜0．05);CINⅡ/Ⅲ组的 cyclin G1 mRNA阳性表达率(45．5%)与 CINⅠ组(47．6%)的差异无统计学意义(P ＞0．05)。

正常对照组、CIN组和宫颈癌组的cyclin G1蛋白阳性表达率分别为5．6%、51．2%和71．7%，呈递增趋势，且差异均有显著性意义(P＜0．05);CINⅡ/Ⅲ组的cyclin G1蛋白阳性表达率(59．1%)与CINⅠ组(42．9%)比差异无统计学意义(P＞0．05)。

2．2 cyclin G1 mRNA与cyclin G1蛋白表达的相关性 在所检测的107标本中，cyclin G1 mRNA阳性表达而cyclin G1蛋白阴性表达10例，cyclin G1mRNA阴性表达而cyclin G1蛋白阳性表达16例，两者都阳性表达40例，两者都阴性表达41例。经Spearman等级相关分析发现，两者呈显著正相关，相关系数r=0．530，P=0．000。参见表2。进一步分析显示，在正常对照组、CIN组和宫颈癌组中，cyclin G1蛋白与cyclin G1 mRNA的表达均呈显著正相关，相关系数和P值分别为r=0．686，P=0．002;r=0．445，P=0．003 和 r=0．387，P=0．008。

2．3 宫颈癌cyclin G1mRNA、cyclin G1蛋白的表达与临床病理因素的关系 如表3结果所示，宫颈癌组的cyclin G1 mRNA阳性表达率与淋巴结转移、组织学分级、临床分期、肿瘤大小、间质浸润深度和有无脉管或宫旁浸润等临床病理因素均无明显关系(P＞0．05)，但cyclin G1蛋白阳性表达率与淋巴结转移有关(P ＜0．05)。

3 讨论

Cyclin G是一类发现较晚的细胞周期蛋白，目前认为它的家族可能包括cyclin G1、cyclin G2、cyclin I三个亚型［2］。虽然cyclin G1和G2在序列上属同系物，但它们可能各自有独特的生理学作用［3］。cyclin G1 是 1993 年 Tamura 等［4］在鼠成纤维细胞中意外发现的，其确切功能至今还不明确。Skotzko等［5］发现在成骨肉瘤细胞中有cyclin G1的超表达和P53、RB抑癌基因的低表达，采用逆转录病毒载体将cyclin G1反义核酸导入成骨肉瘤中，可诱导瘤细胞的凋亡，这说明cyclin G1可能对成骨肉瘤的发生有促进作用。据现有资料显示，cyclin G1的高表达还与多种消化道肿瘤、白血病等的发生有关［6，7］，但cyclin G1表达与宫颈癌关系的研究却鲜有报道。梁静等［8］用免疫组化技术检测结果显示，cyclin G1在正常宫颈组几乎没有表达，而在CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宫颈癌各组的阳性表达率和表达强度逐渐增加，并且在各级病变宫颈组织中的阳性着色区域和病变区域基本相符，并因此认为cyclin G1的过度表达提示宫颈细胞的增殖能力强，并与宫颈病变的发展呈正相关。

本实验用免疫组化和原位杂交技术检测结果显示，CIN组与宫颈癌组的cyclin G1 mRNA和cyclin G1蛋白都有高表达，而且阳性表达部位与宫颈病变部位基本相符;CIN组与宫颈癌组的cyclin G1 mRNA阳性表达率均显著高于正常对照组(P＜0．05)，尤其是cyclin G1蛋白在正常对照组、CIN组和宫颈癌组的阳性表达率呈逐渐增高趋势(P＜0．05)。在正常对照组、CINⅠ组、CINⅡ/Ⅲ组和宫颈癌组中，cyclin G1 mRNA和蛋白的阳性表达强度与宫颈病变级别均呈正相关(r分别为0．378和0．487)。这提示cyclin G1在宫颈癌的癌前病变中就已显著升高，可能与宫颈病变的发展和宫颈癌的发生密切相关。这与本课题前期研究结果cyclin G1蛋白在正常对照组、CIN组和宫颈癌组的阳性表达率呈逐渐增高趋势高度一致［1］，也与梁静［8］的报道基本相符。

Shimizu 等［9］研究结果显示，用 cyclin G1 mRNA反义互补的寡核苷酸可抑制cyclin G1蛋白的表达，并表明cyclin Gl可能与G2/M期检测点的调控有关。本实验结果显示，cyclin G1蛋白与cyclin G1 mRNA的表达具有显著正相关(r=0．530，P=0．000)，这说明cyclin G1蛋白的高表达可能是其mRNA转录水平增高所致，这种高表达可能会使宫颈癌细胞跨越G2/M期调控点，加速细胞周期进程，促进宫颈恶性细胞克隆的无限增殖。但本实验也发现，有16例 cyclin G1蛋白阳性表达而cyclin G1 mRNA却呈阴性表达，这可能是所采用的石蜡包埋标本会降解部分mRNA以及会影响核酸探针的穿透从而降低杂交信号，使cyclin G1 mRNA出现假阴性结果，而cyclin G1蛋白却相对稳定不容易降解。这也提示进一步的相关实验最好采用新鲜标本冰冻切片。

本实验结果还显示，cyclin G1 mRNA的阳性表达率与肿瘤组织学分级、临床分期、肿瘤大小、间质浸润深度、有无脉管或宫旁浸润和淋巴结转移等临床病理因素均无明显关系(P＞0．05)，但cyclin G1蛋白的阳性表达率与淋巴结转移有关(P＜0．05)。这说明cyclin G1对宫颈癌的作用机制复杂，可能涉及到更为复杂的分子生物学基础，但也在一定程度上提示它与宫颈癌恶性侵袭有关，宫颈癌cyclin G1蛋白的高表达可能预示患者预后不良。

综上所述，cyclin G1 mRNA和蛋白在宫颈癌中均有高表达，可能与宫颈癌的发生有关;cyclin G1蛋白的高表达可能是其mRNA转录水平增高所致，并可能与宫颈癌恶性侵袭有关。但宫颈癌的发病原因复杂，仅仅cyclin G1的过表达可能不足以引起多数宫颈细胞发生转化，需要多种癌基因和抑癌基因间的相互调节，协同作用。因此，cyclin G1在宫颈癌发生发展过程中更多的作用机制及其分子生物学基础还有待于进一步研究。

1 翁玉英，孙蓬明，林东红et al．宫颈癌cyclin G1表达与HPV分子亚型感染的研究［J］．中国妇幼保健，2010;25(15):2118-2121．

2 Kimura SH，Nojima H．Cyclin G1 associates with MDM2 and regulates accumulation and degradation of p53 protein［J］．Genes Cells，2002;7(8):869-880．

3 Horne M C，Goolsby G L，Donaldson K L et al．Cyclin G1 and cyclin G2 comprise a new family of cyclins with contrasting tissue-specific and cell cycle-regulated expression［J］．J Biol Chem，1996;271(11):6050-6061．

4 Tamura K，Kanaoka Y，Jinno S et al．Cyclin G:a new mammalian cyclin with homology to fission yeast cigl［J］．Oncogene，1993;8(8):2113-2118．

5 Skotzko M，Wu L，Anderson W F etal．Retroviral vectormediated gene transfer of antisense Cyclin Gl(CYC Gl)inhibits proliferation of human osteogenic sarcoma cells［J］．Cancer Res，1995;55(23):5493-5498．

6 林东红，陈惠瑜，胡建达．白血病细胞周期蛋白G基因mRNA的表达及其临床意义［J］．中国肿瘤生物治疗杂志，2006;13(5):376-380．

7 Gramantieri L，Ferracin M，Fornari F et al．Cyclin G1 is a target of miR-122a，a microRNA frequently down-regulated in human hepatocellular carcinoma［J］．Cancer Res，2007;67(13):6092-6099．

8 梁 静，卞美璐，刘 霞．cyclin G1在宫颈上皮内瘤变和宫颈癌中的表达［J］．中日友好医院学报，2005;19(2):67-69，72．

9 Shimizu A，Nishida J，Ueoka Y etal．Cyclin G contributes to G2/M arrest of cells in response to DNA damage［J］．Biochem Biophys Res Commun，1998;242:529-533．