IL-10基因启动子多态性与皖南地区汉族人群支气管哮喘的相关性研究①

邢 飞 姜玉新 刘文艳 李朝品 王 莹 (皖南医学院医学寄生虫学教研室，芜湖 241002)

哮喘为临床常见病、多发病，其发病机制尚未完全明晰，受遗传和环境的影响，确定哮喘易感性的相关基因成为国内外病因学研究热点之一［1，2］。目前已发现几百个哮喘易感性基因，其中IL－10基因启动子是目前东亚人群研究较多的哮喘相关易感基因，但其单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)在不同种族人群中与支气管哮喘及其相关表型的联系不尽相同。而IL－10基因启动子SNPs与安徽皖南地区汉族人群支气管哮喘的相关性尚未有相关报道。鉴于此，本研究采用病例－对照方法，以安徽皖南地区汉族人群正常个体和支气管哮喘患者为研究对象，采用聚合酶链反应及直接基因测序法比较病例组与对照组间基因型、等位基因频率的差异，探讨 IL－10基因启动子 －1082G/A、－819C/T、－592C/A位点多态性与安徽皖南地区汉族人群支气管哮喘的相关性，以期为哮喘病的诊断提供早期筛查方法。

1 材料与方法

1．1 研究对象 门诊及住院的哮喘患者183例，均来自于皖南医学院弋矶山医院呼吸内科和芜湖第二人民医院门诊，为安徽皖南地区长期居住人口(≥10年)，年龄18～72岁，平均为(34．33±12．942)岁。均符合中华医学会呼吸病分会哮喘学组制定的哮喘诊断标准(2008年修订)。对照组151例均来自于皖南医学院弋矶山医院体检中心及自愿者(皖南地区常住人口)，年龄19～62岁，平均为(27．85±2．267)岁;均无过敏性疾病的症状或病史并排除肝、肾等疾病，见表1。所有研究对象为皖南地区汉族，均签有知情同意书。

1．2 研究方法

1．2．1 样本采集及DNA提取 采集受检者外周静脉血2 ml，用人类基因组DNA提取试剂盒［生工生物工程(上海)有限公司］提取基因组DNA。

1．2．2 引物设计及合成 根据网络数据库(NCBI)及Hapmap数据库公布的人类DNA核酸序列设计特异性引物(表2)。由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1．2．3 PCR 扩增 反应体系50μl:模板3μl，引物F 1 μl，R 引物 1 μl，dNTP 1 μl，10 × PCR Buffer 5 μl，Taq 酶 5 U/μl 0．5 μl，双蒸水 34．5 μl、MgCl24 μl;PCR反应条件:变性95℃ 15分钟，变性95℃ 20秒，退火 56℃30秒，延伸 72℃30秒，35个循环，72℃ 5分钟。取5μl PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，电压100 V，电泳25分钟，在Syngene G:BOX荧光凝胶成像系统下进行分析。纯化PCR产物送生工生物工程(上海)有限公司测序。

表1 哮喘组和对照组人口统计学特征Tab．1 Demographic characteristics of asthmatic and control group

表2 三个启动子引物序列Tab．2 Three prom oter primer sequence

1．3 统计学分析 各位点进行Hardy－Weinberg平衡检验以分析样本的可靠性;基因计数法直接计算各组病例和对照组的基因型和等位基因型，采用SPSS16．0软件进行χ2检验;不同基因位点多态性对哮喘的相对危险度采用单变量Logistic回归分析。

2 结果

2．1 Hardy－Weinberg平衡检验 经对病例组和对照组进行 Hardy－Weinberg平衡检验，结果表明:－1082G/A 哮喘组(χ2=1．632，P=0．28)，对照组(χ2=1．315，P=0．61);－ 819C/T 哮喘组(χ2=1．471，P=0．15)，对照组(χ2=1．331，P=0．68)。－592C/A 基因哮喘组(χ2=2．291，P=0．45)，对照组(χ2=2．752，P=0．71)。说明本研究所用样本均符合Hardy－Weinberg平衡，可进行后续分析。

2．2 基因型频率和等位基因频率比较 对－1082G/A(rs1800896)、－819C/T(rs1800971)、－592C/A(rs1800972)位点在病例组与对照组中基因型频率和等位基因频率分析，结果(表3、4)显示:在安徽皖南地区汉族人群哮喘组IL－10基因启动子－1082G/A位点，基因型分布与对照组相比有显著差异(χ2=16．659，P ＜0．05)，等位基因 G 明显高于对照组，差异具有统计学意义(χ2=9．122，P ＜ 0．05);而－819C/T位点的基因型分布与对照组无显著差别(χ2=5．326，P ＞0．05)，且等位基因 C 与正常对照组相比差异亦不具有统计学意义(χ2=3．147，P＞0．05);－592C/A位点，基因型分布与对照组存在显著差异(χ2=10．948，P ＜0．05)，且等位基因 A 和G分布与正常对照组相比差异亦有统计学意义(χ2=6．730，P ＜0．05)。

表3 哮喘组和对照组IL-10启动子各位点基因型频率分布Tab．3 The frequency distribution of IL-10 promoter each loci genotypes in allergic asthma and controls

2．3 PCR扩增体系 IL－10基因启动子－1082G/A(rs1800896)、－819C/T(rs1800971)、－ 592C/A(rs1800972)位点多态性对哮喘的相对危险度。单变量Logistic回归分析三个位点基因多态性与哮喘的关系，结果(表5)表明:－1082G/A位点相对GG基因型而言，AG、AA与AG+AA基因型，均能显著增加哮喘发生的危险性，OR值(95%CI)分别为 2．709(1．660 ～ 4．420)、2．214(1．099 ～4．462)、2．597(1．660 ～4．420);而 －819C/T 位点相对CC基因而言，TC、TT、TC+TT基因型均不能增加哮喘发生的危险性，OR值(95%CI)为1．093(0．545 ～ 2．191)、0．635(0．308 ～ 1．309)、0．876(0．449～1．708);－592C/A(rs1800972)位点相对CC基因型而言，AC、CC与AC+CC基因型，均能显著增加哮喘发生的危险性，OR值(95%CI)分别为 2．329(1．363 ～ 3．981)、2．432(1．247 ～4．724)、2．355(1．407 ～3．942)。

表4 哮喘组和对照组IL-10启动子各位点等位基因频率分布Tab．4 The frequency distribution of IL-10 promoter each loci alleles in allergic asthma and controls

表5 IL-10启动子各位点的不同基因型对哮喘的相对危险度Tab．5 The IL-10 promoter each loci genotypes odds ratio of the genotypes to asthm a severity

3 讨论

人IL－10主要参与抑制和终止炎症反应，如抑制促炎性细胞因子的合成与释放，包括 TNF－1β、GM－CSF、IL－5 等［3］。 IL－10 基 因 启 动 子 中 的－1082G/A、－819C/T和 －592C/A位点定位于1q31－32染色体，IL－10的表达水平很大程度上受遗传控制［4］。低水平的IL－10可能与哮喘尤其是重度哮喘的发病机理有关［5］，而 －1082A/G、－819T/C和－592A/C的多态性可影响IL－10自身的产生［6］。Kim［7］研究阿司匹林过敏性哮喘的病例－对照中发现－1082A/G与阿司匹林过敏性哮喘显著关联。Bossé等［8］亦发现 IL－10 基因启动子 － 1082G/A、－819C/T和－592C/A的多态性与哮喘发生有关。但Kim等［9］发现这三个启动子位点基因型和单体型频率在儿童哮喘中无显著的相关性。李志方等［10］也发现IL－10基因启动子这3个位点的多态性与小儿哮喘易感性无关。本研究发现－1082G/A和－592C/A的多态性与安徽皖南地区汉族哮喘有显著相关性，而－819C/T位点无相关性。

已有研究表明，－1082G/A的AA基因型在气道高反应性(AHR)中比AG或 GG基因型多，且－1082A比－1082G更能显著地减少启动子的活性［7］。但 Zedan 等［11］发现埃及儿童哮喘患者－1082G/G基因频率显著增高，而－1082G/A基因频率却显著降低。而在日本儿童中发现－1082G/A基因多态性与日本儿童食物过敏有相关性［12］。最近研究发现虽然－819C/T和－592C/T的多态性与哮喘发病有关联，但基因－基因分析与哮喘和过敏体质无相关性［13］。本研究发现－1082/A(rs1800896)位点 AG、AA、AG+AA基因型和 －592C/A(rs1800872)位点AC、CC、AC+CC基因型均与安徽皖南地区汉族哮喘有相关性。而 －819C/T(rs1800871)位点TC、TT、TC+TT基因型均与哮喘无相关性。总之，不同地区人群其单核苷酸多态性与同一疾病的相关性不同，其相关机制有待进一步研究。

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