实时荧光定量PCR方法检测非霍奇金淋巴瘤患者B淋巴细胞刺激因子表达水平①

王金湖 王 梅 杨剑虹 王旭东 申娴娟 浦 江 鞠少卿

(江苏省太仓市第一人民医院检验科，太仓 215400)

B淋巴细胞刺激因子(BAFF)是1999年发现的TNF超家族的成员之一［1］，BAFF具有特异性激活B淋巴细胞，促进B细胞增殖等功能。但新近研究发现BAFF过量表达会导致一些恶性肿瘤的发生，包括非霍奇金淋巴瘤(NHL)。因此我们利用LightCycler实时荧光定量PCR仪建立定量检测BAFFmRNA的方法，测定人NHL外周血中BAFF mRNA含量，探讨BAFF基因表达水平与NHL的相关性。

1 材料与方法

1．1 试剂与耗材

1．1．1 标本来源 20名健康献血者，来自本院体检中心体检健康者，其中女性13例，男性7例，年龄18～42岁，平均(25±7)岁。47例NHL患者，2007年8月～2008年8月来本院和南通大学附属医院的住院患者，其中男性27例，女性20例，年龄32～83岁，平均年龄(60±7)岁。

1．1．2 主要试剂与仪器 SuperScriptTMⅢ逆转录试剂盒(美国Fermentas公司);pGEM－T easy载体、质粒提取试剂盒、IPTG、dNTPS等(美国 Promega公司);胶回收试剂盒(上海华舜生物工程公司)。PTC－200 PCR扩增仪(美国MJ公司);LightCycler定量PCR扩增仪(德国Roche公司);U－0080D核酸紫外检测日本Hitachi公司);Dolphin－Doc凝胶成像系统(美国WEALTEC公司)。

1．2 实验方法

1．2．1 外周血中单个核细胞的分离 无菌采取新鲜血液3 ml，用EDTA抗凝。取淋巴细胞分离液(按与血液1∶2的比例)，加入到15 ml锥形离心管中，再将血液沿管壁轻轻铺到分离液上面，2 000 r/min离心20分钟，取血浆层与分层液交界处浑浊的灰白层(富含单个核细胞)，用生理盐水洗涤2次，1 500 r/min离心10分钟，最后弃去上清，－80℃冰箱保存。

1．2．2 引物设计 引物设计根据BAFF(注册号为AY129225)和内参GAPDH(注册号为NC_000012．10)全序列，应用 Beacon Designer 2．1软件，设计引物，由上海生工生物工程公司合成。BAFF－s 5'－CACGCCTTACTTCTTGCC－3'，BAFF－as 5'－CTTGGAGGATCGGACAG－3'，产物长度 102 bp;GAPDH－s 5'－CGGAGTCAACGGATTGGTCGTAT－3'，GAPDH－as 5'－AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC－3'，产物长度193 bp。

1．2．3 RNA的抽提与逆转录聚合酶反应(RTPCR)Trizol法提取细胞总RNA，核酸蛋白紫外分析仪检测RNA质量和浓度。取总RNA 3μg进行逆转录反应，体系含 5×RT Buffer，dNTPs，Oligo(dT)18，RNase抑制剂 20 U，RT 酶 4 U，37℃ 1小时。cDNA置－20℃保存。

1．2．4 目的片段的扩增 取 cDNA 3μl，用引物BAFF－S 和 BAFF－AS 于 PTC－200 PCR 扩增仪进行PCR扩增反应，条件如下:94℃预变性3分钟，然后94℃ 30秒，55℃ 40秒，72℃ 30秒共33个循环，最后72℃延伸5分钟。

1．2．5 BAFF定量质粒标准品的构建 将电泳和胶回收的PCR产物与pGEM－T easy载体4℃连接过夜。将连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α涂布于含X－gal和IPTG并具Amp抗性的1．5%琼脂平皿上，37℃倒置培养14～16小时。经蓝白斑筛选，EcoRⅠ酶切初步鉴定，阳性克隆行测序分析(由上海博亚公司完成)。将筛选出的阳性菌株扩增，抽提质粒，准确定量10倍系列稀释，作为标准品－20℃保存。

1．2．6 荧光定量PCR检测 反应条件93℃预变性2分钟，然后93℃ 5秒，60℃ 35秒，共40个循环。反应结束后用计算机自动根据循环阈值(Cycle threshold，Ct)与其对应的不同定量模板拷贝数对数值拟合作图，绘制出BAFF和GADPH的标准曲线。

1．2．7 BAFF mRNA的表达水平检测 将标本的cDNA模板与不同稀释度的标准品分别加入18μl PCR反应液中，根据标准曲线得到BAFF和GADPH拷贝数及相应的Ct值。为了消除样本、逆转录和PCR反应的差异，以BAFFmRNA和GADPH mRNA表达水平拷贝数对数值比值作为评价BAFF表达水平的指标。

1．3 重复性试验 选择高、低两种浓度的标本，批内连续测定10次，计算批内变异系数;同样将此两份标本连续测定5天，每天测定2次，计算批间变异系数。

1．4 统计学分析 用SPSS16．0统计分析软件计算均数、标准差(S)和变异系数(CV)。

2 结果

2．1 RNA的纯度与浓度 Trizol法提取NHL患者PBMCs总RNA，经1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，显示清晰的 28S、18S 条带，28S/18S≥1．5，提示总RNA完整性良好(见图1)。用核酸蛋白紫外分析仪检测A260/A280的比值以鉴定RNA抽提质量，1．8≤A260/A280≤2．0，提示总 RNA 质量较好，同时测其标本总RNA浓度为100～860 μg/m l。

2．2 RT－PCR扩增目的片段 以cDNA为模板，用BAFF的引物，经LightCycler扩增应得102 bp的目的片段，经1．5%琼脂糖凝胶电泳，结果显示扩增出的目的片段大小与预期值相符合(图2)。回收目的条带用于PCR产物的克隆。

2．3 pGEM－T easy－BAFF质粒的构建和鉴定 经胶回收的PCR电泳产物与T载体连接后，转化E．Coli，DH5α，获得重组质粒，挑一个白色单菌落接种于5 ml LB液体培养基37℃孵箱培养过夜，取1 ml放入EP管内送去测序，结果证实序列与NCBI基因库BAFF序列同源性为100%(图3)。

图1 1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量Fig．1 1%formaldehyde denaturing agarose gel electrophoresis to detect the quality of total RNA

2．4 标准曲线和方法的特异性 将质粒标准品进行10倍倍比稀释，同时用建立的荧光定量PCR测定，显示灵敏度为10 pg/ml。将检测的临界点定在PCR产物进入指数增长期的起始点即循环阈值(threshold cycle，Ct)处。将Ct值与其对应的不同定量模板数的对数值拟合作图，其中横坐标代表不同定量模板起始拷贝数的对数(log10)，纵坐标代表Ct值，得出定量标准曲线(图4A)。显示Ct值和模板起始浓度的log值之间具有较好的线性关系r=0．99。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可根据标准曲线计算出该样品的起始模板拷贝数。为了验证SYBR GreenⅠ染料方法的特异性，测定PCR扩增产物的熔解曲线(图4B)，可见熔解曲线峰值单一，表明PCR反应条件选择适当，产物特异性强，无非特异性产物。

2．5 重复性检测 选择高、低浓度标准品，连续测定五天，每天测定5次，计算批间变异系数，得其批间CV;将上述高、低标准品重复测定10次，得其批内CV(见表1)。

2．6 BAFFmRNA在NHL患者外周血中的表达对47例NHL患者外周血及健康对照者PBMCs进行定量检测。测定结果显示NHL患者和健康对照者PBMCs BAFF mRNA表达量分别为(0．48±0．023，0．25 ± 0．023)，两组结果具有显著性差异(P=0．0001，见图5)。

图2 琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物Fig．2 The PCR p roduct in gel electrophoresis

图3 pGEM-T easy-BAFF克隆测序结果Fig．3 The results of cloning and sequencing of pGEM-T easy-BAFF

图4 BAFF标准品检测的标准曲线(A，R=0．99)和熔解曲线(B)Fig．4 The standard curve(A，R=0.99)and real-time PCR melt curve(B)of BAFF standard sample

表1 BAFF基因荧光定量测定的批内和批间CV值Tab．1 The vatiation coefficients of intra-assay and interassay of BAFF detected by RFQ-PCR

图5 BAFF在NHL组和正常对照组PBMCs中的表达Fig．5 The expression of BAFF in NHL and normal control

3 讨论

BAFF通过与其细胞表面的3个受体(TACI、BCMA、BAFF－R)结合而主要调节B细胞的活化存活、增生和分泌，还能促进免疫球蛋白产生、调节免疫反应［2－4］。近年来国内外的研究显示，系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(Sjögren syndrome，SS)、多发性骨髓瘤(MM)、非霍奇金氏病(SLE)等疾病患者BAFF及其受体蛋白和(或)mRNA表达水平有异常改变［5－8］，因此对 BAFF表达水平进行准确定量具有重要临床意义。

为测定人NHL外周血中BAFFmRNA含量，探讨BAFF基因表达水平与NHL的相关性，我们利用LightCycler实时荧光定量PCR仪建立定量检测BAFFmRNA的方法并进行方法学评价。DNA结合荧光染料SYBR GreenⅠ是RTFQ－PCR常用的荧光检测模式之一，与杂交探针相比，其特异性相对较低，但操作简便、价格较低，所以应用较广。由于荧光染料可以和所有的DNA结合，为了避免基因组DNA污染，可采用跨越内含子的方法，在BAFF基因保守区设计引物，并通过优化反应体系，设计出了荧光染料法检测BAFFmRNA定量方法。本课题设计的染料法检测BAFF的荧光定量PCR方法，在进行琼脂糖电泳时未发现明显的非特异性条带，并运用熔解曲线分析确定荧光捕获点，以进一步确定检测的特异性。同时为了消除样本、逆转录和PCR反应的差异，以BAFFmRNA和GADPH mRNA表达水平拷贝数对数值比值作为评价BAFF表达水平的指标，结果更为客观可靠。

我国淋巴瘤的死亡率为1．5/10万，排在恶性肿瘤死亡的第11～13位。而非霍奇金淋巴瘤占淋巴瘤的90%以上，由于其原发性结外组织多见，跳跃性转移的方式，且易发生早期远处扩散，有的病例在临床确诊时已播散全身。因此，我们选择BAFF在NHL中的作用进行研究。国外已有研究显示BAFF mRNA在NHL患者肿瘤组织中的表达［8］。国内鞠少卿等［9］研究发现NHL患者外周血中BAFF蛋白水平并不高于正常对照，可能是由于所选血标本已经接受过药物治疗。因此，本次实验拟先在基因水平研究BAFF的表达变化，所选标本均是未经药物治疗的血标本，即在患者入院时采集血标本，随即进行分离提取RNA，经过逆转录检测 BAFFmRNA水平。研究结果显示BAFF mRNA在NHL患者外周血中表达，且表达量显著高于正常对照组。说明BAFF在NHL的发生、发展中可能起到一定的作用，值得进一步的研究。

1 Moore P A，Belvedere O，Orr A et al．BLys:member of the tumor necrosis factor family and B lymphocyte stimulator ［J］．Science，1999;285:260－263．

2 Xu S，Lam K P．B cellmaturation protein，which binds the tumor necrosis factor familymembers BAFF and APRIL，is dispensable for humoral immune responses ［J］．Mol Cell Biol，2001;21:4067－4074．

3 Bossen C，Schneider P．BAFF，APRIL and their receptors:structure，function and signaling ［J］．Semin Immunol，2006;18(5):263－275．

4 Lied G A，Berstad A．Functional and clinical aspects of the B－cellactivating factor(BAFF):a narrative review ［J］．Scand JImmunol，2011;73(1):1－7．

5 Hong SD，Reiff A，Yang H T etal．B lymphocyte stimulator expression in pediatric systemic lupus erythematosus and juvenile idiopathic arthritis patients［J］．Arthritis Rheum，2009;60(11):3400－3409．

6 Ju S，Wang Y，Ni H et al．Correlation of expression levels of BLyS and its receptors with multiple myeloma［J］．Clin Biochem，2009;42:387－399．

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8 Novak A J，Grote D M，Stenson M etal．Expression of BLySand its receptors in B－cell non－Hodgkin lymphoma:correlation with disease activity and patient outcome［J］．Blood，2004;104:2247－2253．

9 鞠少卿，倪红兵，王跃国et al．血清BLyS和APRIL水平与非霍奇金氏病关联性的初步研究［J］．中国免疫学杂志，2007;23(7):563－566．