空肠弯曲菌DNA疫苗构建及其疫苗免疫程序研究①

杜联峰 徐岗村 孙万邦 王宜峰 王胜香 罗军敏 姚新生 夏 嫱 杨 瑞 余 妍

(遵义医学院珠海校区/贵州省免疫学研究生教育创新基地，珠海 519041)

空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni，CJ)为人及动物消化道共同易感菌［1］，目前CJ感染已成为全球范围内急性胃肠炎常见的病因之一［2］。CJ感染除引起急性胃肠炎外，还与格林－巴利综合征［3－6］(Guillain－Barrésyndrome，GBS)有非常密切的关系，是导致儿童发生急性迟缓性瘫痪的重要病因，目前尚无有效的预防和治疗措施。本室前期研究空肠弯曲菌重组蛋白PEB1免疫小鼠后可诱导产生较高滴度特异性抗体和致敏淋巴细胞，证明PEB1重组蛋白具有良好的生物免疫活性［7，8］。由于基因疫苗成本低，能诱导体液免疫和细胞免疫，被广泛运用于感染性疾病和肿瘤免疫治疗［9－11］。本研究以空肠弯曲菌peb1A基因为靶点，构建空肠弯曲菌核酸疫苗pcDNA3．1(－)－peb1A，采用不同免疫程序免疫昆明小鼠后检测其抗体滴度，初步评价疫苗的生物免疫活性和免疫程序，为空肠弯曲菌DNA疫苗的进一步研究奠定基础。

1 材料与方法

1．1 材料 PCR试剂盒、各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA标准 Marker 等购自TAKARA公司。PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒、质粒小量抽提试剂盒和NC膜等购自上海生工生物有限公司。jetPEITM转染试剂盒购自达科为生物技术有限公司。质粒大量抽提试剂盒购自QIAGEN公司。HRP－羊抗大鼠IgG、IgM购自北京博奥森生物技术有限公司。

1．2 实验动物 昆明鼠180只，雄性，每剂量组30只，6～8周龄，20～25 g/只，购于遵义医学院动物实验中心。

1．3 表达质粒、工程菌株、细胞和蛋白 质粒pcDNA3．1(－)，含有氨苄青霉素(Amp)和潮霉素(Hygromysin)抗性，全长5．4 kb，为Invitrogen公司产品;重组质粒PET28a(+)－peb1A，E．coli JM109 细菌，E．coli菌株DH5α和COS－7细胞为本室保存;CJ标准株(编号CF－1)28～31 kD外膜蛋白由本室分离纯化提供，置于 －80℃保存［8］。

1．4 重组质粒 pcDNA3．1(－)－peb1A 的构建 以重组质粒pET28a(+)－peb1A为模板亚克隆peb1A，设计 如 下 引 物:上 游5'－CCgAATTCACCATgggCAg－CAgCCATCAT－3'，下 游 为5'－CgCAAgCTTTTATAAACCCCATTTTTTCgCT－3'。PCR扩增peb1A基因。扩增条件为94℃变性4分钟，然后94℃变性30秒，53℃退火45秒，72℃延伸1分钟，最后1个循环结束后再以72℃延伸8分钟，共30个循环。回收纯化目的片段。用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切目的片段与pcDNA3．1(－)，回收纯化后进行DNA连接反应。连接产物转化感受态细胞DH5α，应用氨苄青霉素抗性平板筛选，将重组质粒进行酶切，测序鉴定。

1．5 重组质粒转染细胞及其表达产物鉴定 将处于对数生长期的COS－7细胞接种于6孔细胞培养板中，加入重组质粒 pcDNA3．1(－)－peb1A 与 jetPEI的混合物，37℃，5%CO2培养48小时。转染细胞培养48小时后，收集转染细胞，PBS洗涤细胞2次后，加100μl含PMSF的RIPA裂解液裂解细胞30分钟，离心取上清液，进行SDS－PAGE电泳和 Western blot分析，其中Anti－His Tag抗体为一抗，羊抗小鼠IgGHRP为二抗，采用HRP－DAB底物显色试剂盒检测。

1．6 免疫分组及免疫程序 免疫接种途径、剂量:接种前观察昆明小鼠生活状态5天，生活状态正常，免疫前2天于注射处先注射0．25%利多卡因50μl/腿，免疫时于小鼠股四头肌一点注射，每只小鼠100μl，实验组疫苗的DNA含量为100μg，空载体组疫苗DNA含量为100μg，生理盐水组注射100 μl。每剂量组均为30只小鼠。免疫程序A方案(短程)见表1，免疫程序方B案(长程)见表2。

2 结果

2．1 重组真核表达载体酶切鉴定结果 随机挑取传化成功的单菌落，抽提质粒，经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切鉴定，电泳后得到一个位于812 bp处的小片段和一个位于大小位于5 427 bp处的大片段，表明PCR扩增出的peb1A小片段已经成功插入到质粒pcDNA3．1(－)的多克隆位点中 (图1)。以T7启动子为引物进行序列测定，经软件分析结果显示获得了正确的peb1A基因序列，插入片段阅读框正确，质粒构建成功。

2．2 重组质粒在COS－7细胞中的表达 重组质粒和 pcDNA3．1(－)转染真核细胞 COS－7， Western blot鉴定，重组质粒 pcDNA3．1(－)－peb1A 转染的 COS－7细胞中检测到了一条特异条带，相对分子量在28kD左右，而转染空质粒细胞中则没有条带，结果见(图2)。

表1 CJ p cDNA3．1(-)-peb1A免疫分组及免疫程序A方案Tab．1 The immune method of CJ pcDNA3．1(-)-peb1A on themice(A)

表2 CJ pcDNA3．1(-)-peb1A免疫分组及免疫程序B方案Tab．2 The immune method of CJ pcDNA3．1(-)-peb1A on themice(B)

2．3 DNA疫苗免疫接种一般情况观察结果 实验动物免疫接种后，各免疫组动物精神状况良好，进食、大便情况正常，体重较免疫前稍有增加，皮毛光滑，局部注射部位无硬结、溃烂、出血，未见死亡。

图1 重组质粒pcDNA3．1(-)-peb1A的双酶切鉴定Fig．1 Restrictive enzyme digestion analysis of recombinant p lasm id pcDNA3．1(-)-peb1A

图2 重组质粒转染COS-7细胞的W estern blot鉴定结果Fig．2 The results of Western blot for COS-7 cells transfected with plasm id pcDNA3．1-peb1A

小鼠血清IgG水平检测(B方案，见表4):①裸DNA组IgG水平与两对照组比较，第15天和第25天明显增高(P＜0．05)，两对照组之间无统计学差异(P＞0．05)。②实验组小鼠血清IgG水平，第25、35、45天与第15天比较，呈逐渐下降趋势。

小鼠血清IgG抗体最高OD值比较(A方案与B方案):小鼠血清IgG水平A免疫方案第20天达到最高值，B免疫方案第15天达到最高值。对两免疫方案小鼠血清IgG最高OD值进行比较，结果显示(表5):裸DNA组A免疫方案第20天均高于B免疫方案第15天，有显著性差异(P＜0．05)。

表3 CJ pcDNA3．1(-)-peb1A免疫小鼠后血清IgG抗体OD值测定结果(A方案)Tab．3 OD values of the serum IgG antibody levels in mice after immunized with CJ pcDNA3．1(-)-peb1A(Program A)

表4 CJ pcDNA3．1(-)-peb1A疫苗免疫小鼠后IgG抗体OD值测定结果(B方案)Tab．4 OD values of the serum IgG antibody levels in miceafter immunized with CJ pcDNA3．1(-)-peb1A(Program B)

表5 A、B两免疫方案小鼠血清IgG抗体最高OD值比较Tab．5 Comparison between immune program A and B of themax IgG OD value

2．5 小鼠血清IgM抗体水平变化检测 A免疫方案血清IgM抗体水平检测，结果显示(见表6):①裸DNA组IgM水平与两对照组比较，第10天明显增高，有显著性差异(P＜0．05)。②实验组小鼠血清IgM水平，第20、30天与第10天比较，逐渐降低。

B免疫方案血清IgM抗体水平检测，结果见表7:①裸DNA组IgM水平与两对照组比较，第15天明显增高，有显著性差异(P＜0．05)。②实验组小鼠血清IgM水平，第25、35、45天与第15天比较，逐渐降低至对照组水平。

A免疫方案与B免疫方案血清IgM抗体最高OD值比较:A免疫方案中，小鼠血清IgM水平第10天达到最高值，B免疫方案第15天达到最高值，对两免疫方案小鼠血清IgM抗体最高OD值进行比较，结果见表8:裸DNA组第10天高于第15天，但是无显著性差异(P＞0．05)。

表6 CJ pcDNA3．1(-)-peb1A疫苗免疫小鼠后血清IgM抗体OD值测定结果(A方案)Tab．6 OD values of the serum IgM antibody levels in mice after immunized with CJ pcDNA3．1(-)-peb1A(Program A)

表7 CJ pcDNA3．1(-)-peb1A疫苗免疫小鼠后血清IgM抗体OD值测定结果(B方案)Tab．7 OD values of the serum IgM antibody levels in mice after immunized with CJ pcDNA3．1(-)-peb1A(Program B)

表8 A、B免疫方案小鼠血清IgM抗体最高OD值比较Tab．8 Comparison between immune program A and B of themax IgM OD value

3 讨论

DNA疫苗具有制备简单、成本较低、使用简单;其在体内可长期表达抗原蛋白，产生持久应答;质粒载体免疫原性低等优点［12，13］。自上世纪90年代初问世以来，已在多种疾病的防治研究中显示出巨大的应用潜力，但是裸DNA疫苗接种存在剂量偏大、生物利用度低、持续时间不够长等缺点。主要因为裸DNA疫苗注射给药后，经过细胞间质和细胞质的停留直至转录期间，绝大多数会被核酸酶降解失活。为了增强DNA疫苗的免疫保护效果，已进行的探索包括对保护性抗原、表达载体、免疫佐剂、免疫途径等策略的优化［14－17］。

研制基因疫苗的前提和关键是候选基因的确定和获得。近年对CJ致病机制和相关致病基因的研究发现:由peb1A基因编码表达的PEB1蛋白存在于98%CJ菌体表面，具有十分稳定而保守的免疫原性［18，19］。鉴于该蛋白在CJ致肠道感染中的特殊重要性，且其编码基因非常保守，我们选用peb1A基因作为DNA疫苗的抗原基因。基因表达载体的选择对基因转染能否成功也很关键，pcDNA3．1(－)能使外源基因在哺乳动物细胞中获得瞬时或稳定的表达，是一个理想的真核质粒表达载体。COS－7细胞瞬时表达系统是迅速把克隆化基因在哺乳动物细胞上表达的常用方法。因此，我们选择peb1A基因为目的抗原基因，构建了重组质粒 pcDNA3．1(－)－peb1A。重组质粒经双酶切、PCR和 DNA测序鉴定，并证实构建成功，转染到真核细胞COS－7，免疫印迹技术检测重组质粒在 COS－7细胞中较好的表达。

本实验采用的肌肉注射法是目前基因疫苗免疫最常用的方法，对于空肠弯曲菌这种胞外菌的感染，主要依靠体液免疫特异性抗体杀灭细菌、中和毒素来发挥免疫保护作用。在本实验中，CJ基因疫苗免疫小鼠后，裸DNA组与空载体和NS对照组比较，均诱导产生了一定滴度的特异性IgM和IgG，说明CJ基因疫苗具有一定的免疫原性，能诱发小鼠机体产生特异性抗体。

本研究成功构建空肠弯曲菌peb1A基因真核表达载体并在 COS－7细胞中正确表达。CJ pcDNA3．1(－)－peblA 疫苗具有免疫原性，在同一剂量以短程的免疫程序和长程的免疫程序进行比较，结果肌肉注射方式，短程免疫效果较理想。疫苗接种后介导特异性IgM和IgG抗体应答与一般疫苗免疫应答规律相同。本研究结果为进一步研究空肠弯曲菌DNA疫苗能否使实验动物产生有效的免疫保护力，降低感染发生率和死亡率，提供了新的实验依据。

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