实时荧光PCR和ELISA在乙型肝炎病毒检测中的应用价值

屈 丹

湖南省衡阳市妇幼保健院检验科，湖南衡阳 421001

乙肝正在全世界蔓延，不同国家、地区的HBV的感染率强度有一定的差异,而我国属于乙肝的高发地域,1~59岁人群中乙肝表面抗原携带率为7.18%,其中一定数量的乙肝病毒携带者能逐渐转变为慢性肝炎,并要及时接受相关治疗。如今，在荧光定量聚合酶链反应技术(FQ-PCR)不断进步的情况下，其快、稳、准的特点得到了充分的发挥，此项检测技术在临床上已得到大面积的推广，尤其是在HBV-DNA的检测中显得至关重要，而用酶联免疫吸附技术(ELISA)在HBV标志物的检测中只能提供病毒已侵入人体的数据,用实时荧光聚合酶链反应技术(PCR)则可以知道患者体内HBV的具体状态。本次实验同时采用FQ-PCR技术对2010年12月—2012年3月间在该院接受乙肝病毒检测的217例血清标本进行 HBV-DNA检测和ELISA技术进行HBVM检测，最后比较结果并进行讨论。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取患者血清标本217例，并同时采用FQ-PCR技术对217例血清标本进行HBV-DNA检测和ELISA技术进行HBV-M检测。

1.2 仪器与试剂

ELISA试剂盒；HBV-DNA的FQ-PCR试剂。B10680酶标仪；ROTOR GENE 3000实时荧光定量PCR仪。

1.3 方法

HBV-M检测使用ELISA技术，实验操作与结果的判断依照试剂说明书进行。HBV-DNA检测使用FQ-PCR技术，实时荧光法检测核酸的扩增，实验操作依照试剂盒说明书进行。

1.4 统计方法

实验结果采用χ2检验进行判定。

2 结果

217例标本由上述两种技术同时进行测定,由PCR技术检测出的阳性率与ELISA技术检测出的阳性率之间比较，差异有统计学意义（P<0.05）；而 HBV-DNA阳性拷贝数与 ELISA技术检测出的“大三阳”和“小三阳”两组之间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。 见表 1。

表1 ELISA检测HBV-M和FQ-PCR检测HBV-DNA的结果

3 讨论

对于乙肝病毒的诊断主要是依靠血清特异性抗原、抗体与HBV-DNA的检测,而运用ELISA技术检测HBV-M则是诊断患者是否感染HBV的传统方法,它可以检测出人体的免疫系统对HBV的具体反应情况。PCR技术可以检测乙肝患者血清中HBV-DNA的拷贝状态,反映患者的病理状况,其提供的信息具有很高的参考价值，能在治疗过程中起到至关重要的作用，帮助医生选择治疗方案。FQ-PCR是在完全闭管的情况下进行检测,没有必要进行PCR的后处理,这样能很好的避免交叉感染,同时运用实时检测技术持续监测在PCR中的反应系统对荧光信号变化的反应情况,而荧光信号在某个阈值附近的循环周期和模板DNA的起始数量的对数值遵循一定的线性关系,根据该线性关系可以准确定量起始模板,且此种定量法的准确率高,能客观地反应出HBV的复制状态[1]。

该实验用HBV-DNA的FQ-PCR检测217例不同的乙肝病毒阳性血清标本后,结果显示HBV-DNA在不同类型的HBV-M阳性标本中，甚至是全阴性标本中都可以检测出来,可是其检出率之间却有一定的差距,该结果提醒我们不能单单依据HBV的血清学检查结果来判定患者携带的病毒是否有传染性[2]。有些患者处于“窗口”期，就是所谓的病毒感染早期,病毒的扩增仅仅限于部分人体组织中，如肝、淋巴等,而血液中极少含有病毒,故用ELISA检测HBV-M过程中的灵敏度、准确度较低,导致HBV的血清学检测结果表现为全阴性。故用HBV-DNA方法对献血人员的筛查就显得非常重要。

该实验从 109例 HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性组患者中，检测出10例阴性的血清HBV-DNA,而某些文献曾有“大三阳”组患者的HBV-DNA阳性检出率为100%的结论，该实验结果与该结论有些许偏差，故并非所有“大三阳”患者都有传播乙肝病毒的能力。造成此种现象的原因可能是乙肝病毒在肝细胞DNA中与抗原基因进行全基因整合或表达，在肝细胞内部只有抗原的表达而无病毒的扩增,所以能在血清中检测出各种类型的HBV抗原,但乙肝病毒却没有在血清中出现，造成了部分HBsAg、HBeAb、HBcAb阳性组患者的HBV-DNA检测为阴性的现象,而在同种情况下，“小三阳”组的发生率(61.3%)要比“大三阳”组的发生率(9.2%)高出许多(P=0.024),虽然这些患者没有传播乙肝病毒的能力,但也不能说明患者已经痊愈,有可能身体的某些组织发生病变，导致机体受损、免疫力降低等情况下，乙肝病毒很有可能会重新扩增,使患者转变成传染源,故对该类型的患者需要进行复查[3]。在“小三阳”组的标本中HBV-DNA拷贝数>105的占HBV-DNA阳性组的20.8%,“大三阳”组却占到了81.8%,明显高出“小三阳”组(P<0.01),与国内一些文献的结论相比无太大的出入。除此之外,HBeAg阳性组的HBV-DNA检出率要大大高于HBeAg阴性组 (P<0.05)，从此结果可以知道检测HBeAg阴转与抗-HBe并不代表患者已经失去传染能力，只是传染性变小,有些患者体内依然存在HBV扩增的可能,此种情况可属于前c区突变。这种突变将使HBeAg不能继续产生,但HBV的扩增受其影响较小,此类患者应继续进行抗病毒的治疗。

4 结语

由上述研究可以看出,在判断乙肝患者传染性强弱方面上,HBV-DNA检测能力要高于血清学的检测指标,但血清学的检测指标在分析HBV感染、病理状况或HBV-DNA的阴性结果但不能排除患者携带HBV的情况下,没有其他的检测方法能够代替它。ELISA法是临床诊断 HBV的传统方法，具有易操作、成本低的特点，它可以检测出人体的免疫系统对HBV的具体反应情况，仅仅可以进行定性分析，而不能进行病毒的定量分析，故PCR定量检测优势较大，值得我们大力推广。

[1]谷香珍，张敬党，王霞，等.乙肝免疫学检测与 HBV-DNA的血清学检测分析[J].现代预防医学，2006，33（3）：383.

[2]张蓓，杨晓云，刘蕊，等.荧光定量 PCR检测 HBV-DNA与乙肝两对半检测结果的相关性讨论[J].河北医学，2006，12(9)：835-838.

[3]李金明.实时荧光 PCR技术[M].北京：人民军医出版社，2009：190.