中药马勃对大鼠皮肤成纤维细胞增殖及胶原合成的影响

石 毅，刘忠英，卢泽源，刘 迪，刘彬彬，周余来，刘 志

（1.吉林大学药学院生物工程实验中心，吉林 长春 130021；2.吉林大学药学院药物分析教研室，吉林 长春 130021；3.吉林大学数学学院，吉林 长春 130012）

中药马勃对大鼠皮肤成纤维细胞增殖及胶原合成的影响

石 毅1，刘忠英2，卢泽源＊，刘 迪1，刘彬彬Δ，周余来1，刘 志3

（1.吉林大学药学院生物工程实验中心，吉林 长春 130021；2.吉林大学药学院药物分析教研室，吉林 长春 130021；3.吉林大学数学学院，吉林 长春 130012）

目的：中药马勃作用于体外培养大鼠皮肤的成纤维细胞，观察大鼠成纤维细胞增殖及胶原合成的能力，探讨马勃有效组分在细胞水平上促皮肤患处愈合的作用机制。方法：运用体外细胞培养技术对新生大鼠乳鼠皮肤的成纤维细胞进行培养，实验分为对照组（不给药组）和马勃有效组分37.5、75.0、150.0及300.0mg·L－1组；实验组于传代培养24h后加入不同浓度的药物，继续培养24、48、72h后收集细胞。采用MTT比色法测定细胞增殖，生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法测定细胞胶原含量。结果：与对照组比较，37.5、75.0、150.0及300.0mg·L－1实验组的成纤维细胞增长率和成纤维细胞胶原合成能力均显著性升高（P＜0.01）。在药物作用时间方面，与对照组比较，在24、48和72h观察细胞增殖率和胶原合成能力均显著增强，72h最强，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论：在不同剂量马勃有效组分作用下，大鼠成纤维细胞活化增殖，胶原合成的能力增强。

马勃；成纤维细胞；细胞增殖；胶原合成

马勃为马勃科植物脱皮马勃、大颓马勃、紫颓马勃的干燥子实体。具有清肺利咽、止血之功效，可促进伤口愈 合［1］。 现 代 研 究 发 现［2－4］： 马 勃 在 抗肿瘤方面也有积极作用。近年来马勃中的化学成分在抗菌和抗癌方面表现出特殊作用，受到医学界关注［5］。马勃煎剂能抑制金黄色葡萄糖球菌、肺炎球菌、绿脓杆菌和变形杆菌生长，在创伤愈合时起到抗菌消炎的作用。马勃亦可以治疗褥疮［6－7］。目前关于马勃促进创伤愈合和修复方面的研究较少，其中有效组分及其对受损细胞的影响机制尚未明确。本实验从细胞水平研究马勃有效组分对大鼠皮肤成纤维细胞增殖及胶原合成的作用，探讨马勃有效组分促皮肤患处愈合在细胞水平上的作用机制，为进一步开发治疗褥疮的中药新药奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 DMEM培养基购于Gibco公司；胎牛血清购于北京四季青公司；中性蛋白酶试剂盒、MTT试剂盒及胶原酶试剂盒购于Sigma公司；胰蛋白酶购于Genview公司。倒置相差荧光显微镜、倒置显微镜（日本奥林巴斯公司）；高压灭菌锅、CO2培养箱（日本三洋公司）；酶标仪EXL－808Ⅰ（德国Eppendorf公司）；离心机（上海安亭科学仪器公司）。

1.2 实验动物 实验大鼠乳鼠购于吉林大学白求恩医学院动物部，动物生产批号：SCXK（J）2007－0003，动物合格证号：0021833。

1.3 马勃促大鼠成纤维细胞增殖有效组分提取、分离［8］利用水、乙醇、乙酸乙酯和石油醚4种极性不同的溶剂分离提取马勃，得到马勃提取物，作用于体外培养的大鼠成纤维细胞，观察各组分对成纤维细胞生长的影响，筛选出马勃有效组分为80%乙醇提取物。

1.4 成纤维细胞培养及分组 取1～7d新生大鼠的乳鼠背部皮肤，通过4.0%中性蛋白酶、0.25%胶原酶进行消化、分离、培养得到原代培养成纤维细胞，再用0.25%胰酶进行消化、分离、培养，得到传代培养成纤维细胞；实验分为对照组和37.5、75.0、150.0和300.0mg·L－1马勃实验组，马勃实验组于传代培养24h后加入不同剂量的药物，继续培养24、48和72h后收集细胞。

1.5 成纤维细胞增殖率的测定［9］成纤维细胞经胰酶消化后转入96孔培养板中（边缘孔用无菌PBS填充），培养24h后，实验组按不同药物剂量给药，对照组给PBS，每组6个复孔。37℃培养24、48和72h，依据3个时间分别在每孔中加MTT（20μL／well），37℃ 培养 4h，3 500r·min－110min，弃上清，加入二甲基亚砜（DMSO）200μL／well，充分振荡，使蓝色结晶完全溶解，然后在酶标仪上于490nm波长处测定吸光度（A）值，计算细胞增殖率：细胞增殖率＝（实验组A值－对照组A值）／对照组A值×100%。

1.6 生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法测定成纤维细胞胶原含量 成纤维细胞经胰酶消化后转入96孔培养板中（边缘孔用无菌PBS填充），培养24、48、72h后，实验组按不同药物剂量给药，对照组给PBS，每组6个复孔，5%CO2、37℃孵育，培养48h，试剂盒检测，依照试剂盒说明书在450nm处进行检测。根据标准曲线的直线回归方程计算样品的含量。

1.7 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理，成纤维细胞增殖测定的A值、成纤维细胞胶原含量以±s表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 不同溶剂马勃提取物作用下成纤维细胞增殖率 水、乙醇、乙酸乙酯和石油醚4种马勃提取物对成纤维细胞增殖均有促进作用，且随剂量的增大而递增，其中马勃乙醇和水提取物对成纤维细胞增殖的作用较好。见图1。

图1 马勃粗提物作用后成纤维细胞增殖率的变化Fig.1 The changes of proliferation rates of fibroblasts after treated with crude extracts from puffball

2.2 不同含量乙醇提取物作用下成纤维细胞增殖率 用水和30%、60%及80%乙醇对马勃进行提取，得4种不同组分，采用MTT法测定成纤维细胞增殖率的变化，结果显示：马勃水提物及各浓度乙醇提取物对成纤维细胞的增殖均有不同程度的促进作用，其中马勃80%乙醇提取物对成纤维细胞增殖作用最明显。见图2。

图2 马勃乙醇提取物作用后成纤维细胞增殖率的变化Fig.2 The changes of proliferation rate of fibroblasts after treated with ethanol extracts from puffball

2.3 不同剂量的马勃有效组分作用下成纤维细胞增殖的变化 用含不同剂量的马勃有效组分（80%乙醇提取物）的培养液培养成纤维细胞，观察细胞增殖情况。与对照组比较，37.5、75.0、150.0及300.0mg·L－1马勃实验组成纤维细胞增长率有显著性升高，差异具有统计学意义 （P＜0.01）。在药物作用时间上，与对照组比较，马勃实验组在24、48和72h细胞增殖率均显著增强，差异有统计学意义 （P＜0.01）。见表1。

2.4 不同剂量有效组分作用下成纤维细胞胶原含量的变化 与对照组比较，37.5、75.0、150.0及300.0mg·L－1马勃实验组成纤维细胞胶原含量有显著升高，差异有统计学意义 （P＜0.01）。在药物作用时间方面，与对照组比较，马勃实验组在24、48和72h观察胶原含量均有显著增强，72h最强，差异有统计学意义 （P＜0.01）。见表2。

表1 各组成纤维细胞增殖率的变化Tab.1 The changes of the proliferation rates of fibroblasts in various groups （n＝6，±s）

表1 各组成纤维细胞增殖率的变化Tab.1 The changes of the proliferation rates of fibroblasts in various groups （n＝6，±s）

＊P＜0.01compared with control group.

Group A490nm Proliferation rate（η／%）24 48 72 Control 0.093±0.002 0.096±0.004 0.098±0.008（t／h）24 48 72 0 0 0 Puffball（mg·L－1）37.5 0.116±0.008＊ 0.126±0.008＊ 0.131±0.100＊ 25＊ 31＊ 34＊75.0 0.130±0.009＊ 0.138±0.009＊ 0.142±0.090＊ 40＊ 44＊ 45＊150.0 0.145±0.008＊ 0.155±0.008＊ 0.164±0.060＊ 56＊ 61＊ 67＊300.0 0.140±0.008＊ 0.152±0.005＊ 0.161±0.110＊ 51＊ 58＊ 64＊

表2 各组成纤维细胞合成胶原含量的变化Tab.2 The changes of the collagen contents of fibroblasts in various groups ［n＝6，±s，ρB／（μg·L－1）］

表2 各组成纤维细胞合成胶原含量的变化Tab.2 The changes of the collagen contents of fibroblasts in various groups ［n＝6，±s，ρB／（μg·L－1）］

＊P＜0.01compared with control group.

Group Collagen content（t／h）24 48 72 Control 0.83±0.12 0.86±0.12 0.88±0.12 Puffball（mg·L－1）37.5 1.26±0.08＊ 1.26±0.10＊ 1.37±0.10＊75.0 2.26±0.09＊ 2.37±0.09＊ 2.36±0.09＊150.0 2.90±0.08＊ 3.12±0.08＊ 3.26±0.06＊300.0 3.01±0.08＊ 3.16±0.05＊ 3.29±0.11＊

3 讨 论

褥疮是临床主要并发症之一，易并发感染而危及生命［10］，目前多选用西药治疗。中药马勃以清热解毒、去腐生肌为主，在治疗创伤愈合时具有抗菌消炎作用，而对于促进创伤愈合和修复方面的报道较少，其中马勃的有效组分对受损细胞的影响机制尚未明确。本研究以大鼠皮肤成纤维细胞作为研究对象，研究马勃有效组分对成纤维细胞增殖、胶原合成的影响，以探讨治疗褥疮的中药治疗作用。

创伤愈合是一个复杂的生物学过程，是进入伤口的成纤维细胞增殖、分化和胶原合成等综合作用的结果。当皮肤破损后，成纤维细胞增殖以及胶原更新是影响伤口重建的关键，其主要依赖于胶原酶的作用，而胶原酶来源于纤维细胞［11］。研究［12］证明：成纤维细胞生物学特性改变，即增殖能力增强和胶原蛋白合成增多在创面愈合形成过程中发挥着重要作用。因而通过改善成纤维细胞的生物学特性能够促进创面愈合的速度。成纤维细胞又是参与创伤修复的主要细胞，具有合成胶原、纤维黏连蛋白及透明质酸等细胞外基质的功能，同时还可分泌多种生长因子来调控修复创面愈合。本研究结果显示：马勃有效组分在细胞水平上对皮肤成纤维细胞的生物学作用，具有剂量和时间的依赖关系，剂量为37.5～150.0mg·L－1范围内，随着马勃剂量的增加，对成纤维细胞增殖效果随之增加。但当药物剂量加大到300mg·L－1时，增殖效果反而略有降低，其中以150mg·L－1剂量促进增殖作用最显著。可见，通过调节马勃有效组分剂量，可以对成纤维细胞增殖幅度进行调控。从给药作用时间方面观察，随着时间的推移，成纤维细胞增殖效率增强，48h细胞增殖效率显著增强，以72h为最强。不同剂量马勃有效组分对成纤维细胞胶原合成剂量效应显示：马勃剂量为37.5～150.0mg·L－1范围内，成纤维细胞胶原合成均有显著增强，并随着给药剂量增高，成纤维细胞胶原合成能力增强，剂量为300mg·L－1时与150mg·L－1作用于成纤维细胞胶原合成能力基本相同。从给药作用时间方面观察，随着作用时间增加，胶原合成能力增强。

综上所述，通过调节马勃有效组分剂量，不仅可以对成纤维细胞增殖幅度进行调控，也可以对成纤维细胞胶原合成进行调控，改变成纤维细胞的生物学特征，本研究为中药马勃有效组分对促患处愈合在细胞水平上的作用机制提供了有力的数据，为进一步开发中药新药奠定了基础。

［1］国家药典编委会 .中华人民共和国药典 （2005年版）［M］.北京：人民卫生出版社，2005：331.

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［3］郭 玫，张 扬.中药马勃的研究概况 ［J］.甘肃中医学院，2010，27 （1）：60－62.

［4］徐 力，马 冰.大马勃体抗肿瘤作用初探 ［J］.中国医药指南，2011，9 （34）：264－265.

［5］黄文琴.脱皮马勃抗肿瘤活性研究 ［J］.当代医学，2010，16 （12）：34－35.

［6］孙菊英，郭朝晖.十种马勃体外抑菌作用的实验研究 ［J］.中药材，1994，17 （4）：372－381.

［7］高京华，刘 芳.马勃治疗褥疮的疗效对照观察 ［J］.现代中医药，2005，25 （4）：29－30.

［8］高云佳，赵庆春，闵 鹏，等.脱皮马勃化学成分的研究 ［J］.中国药物化学杂志，2010，20 （1）：47－49.

［9］Sergeant JM，Taylor CG.Appraised of the MTT assay as a rapid test of chemosensitivity in acute myeloid lenkemin［J］.Br J Cancer，1989，60 （3）：206.

［10］刘凤琴.湿润烧伤膏治疗褥疮的体会 ［J］.实用护理杂志，1993，9 （10）：8.

［11］程治强，李钰珑.生长因子在创伤愈合过程中的机制 ［J］.中国民康医学，2007，19 （10）：875－891.

［12］陈新龙，余明星，陈文山，等.烧伤创面成纤维细胞周期，羟脯氨酸及胶原比例动态变化 ［J］.中华外科杂志，2000，38 （2）：148－150.

＊延边大学药学专业2009级

Δ吉林大学文学院2010级

Effects of traditional puffball on proliferation and collagen synthesis of skin fibroblasts in rats

SHI Yi1，LIU Zhong－ying2，LU Ze－yuan＊，LIU Di1，LIU Bin－binΔ，ZHOU Yu－lai1，LIU Zhi3
（1.Center for Biological Engineering Experiment，School of Pharmacy，Jilin University，Changchun 130021，China；2.Department of Drug Analysis，School of Pharmacy，Jilin University，Changchun 130021，China；3.School of Mathematics，Jilin University，Changchun 130012，China）

Objective To study the effects of puffball on proliferation and collagen synthesis on rat skin fibroblasts，and to investigate the mechanism of enhancing wound healing of active constituent of puffball at the cells level.Methods The rat skin fibroblasts were divided into 5groups，all the cells were treated with puffball（37.5，75.0，150.0and 300.0mg·L－1），except for control group，for 24，48and 72h，respectively.And then MTT was used to detect the proliferation，and the content of collagen were measured by double antibody sandwich ELISA.Results Compared with control group，the cells treated with different concentrations（37.5，75.0，150.0and 300.0mg·L－1）of puffball showed a significant rise both in its proliferation and the ability of collagen synthesis（P＜0.01）.Furthermore，in time－dependant manner，the proliferation rate of cells and collagen synthesis ability were significantly increased after treated for 24，48，72h，especially in 72h（P＜0.01）.Conclusion Puffball with different doses can enhance the proliferation and collagen synthesis in skin fibroblasts of rats.

puffball；fibroblast；cell proliferation；collagen synthesis

R965

A

1671－587Ⅹ（2012）05－0961－04

2012－04－11

吉林省中医药管理局资助课题 （2010－pt063）

石 毅 （1962－），女，吉林省长春市人，研究员，主要从事中药生物工程的研究。

刘 志 （Tel：0431－85166967，E－mail：liuzhi＠jlu.edu.cn）