李 玲,谢 峥
(荆门市第二人民医院,湖北 荆门 448000)
续断又名龙豆、属折、和尚头、川续断等。为川续断科植物川续断DipsacusasperWall.exHenry的干燥根。广泛分布于四川、湖北、云南、西藏等地。资源极为丰富。在《神农本草经》中被列为上品,味苦、辛、微涩,性微温。功能为补肝肾、养筋骨、通关节、和血脉,安胎止血。生品续筋骨、通血脉力胜,多用于风湿痹痛,跌打损伤;炒用补肝肾、安胎止血力强,多用于肾虚腰痛,崩漏胎滑诸症。现代研究已经证明续断中含有生物碱、皂苷类等多种化学成分[1]。本文对续断中总皂苷进行含量测定。
UV-VIS L-7240检测器;UV-754(上海第三分析仪器厂);RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);AS2060B超声仪(AUTOSCIENCE);大孔吸附树脂DM101(天津农药股份有限公司树脂分公司);川续断药材(购自恩施)。
精密称取80℃干燥后的川续断药材1 kg,打成粉末,用95%的乙醇回流提取3次,每次加8倍量乙醇,分别提取至沸腾后计时1.5、1、1 h,过滤,合并滤液,用旋转蒸发仪回收乙醇并浓缩至小体积,转入坩埚中水浴挥干,得浸膏,称重702.7 g,比重0.98。
取6.25 g浸膏水浴挥干,称重为1 g,蒸馏水定容至100 mL,后不再进行任何处理,作为样品I;另取50 g浸膏用蒸馏水定容至500 mL,取20 mL作为样品Ⅱ;另取120 mL溶液分别用110 mL、50 mL、50 mL的水饱和正丁醇萃取3次,合并正丁醇层(上层),回收正丁醇至干,用蒸馏水定容150 mL作为样品Ⅲ。
2.2.1 大孔吸附树脂的预处理 称取20 g大孔树脂,用10倍量无水乙醇浸泡24 h,然后用乙醇洗至洗出液∶水=1∶5无白色浑浊现象,再用蒸馏水洗至无醇,湿法装柱备用。
2.2.2 大孔吸附树脂吸湿率测定 称取3份2 g未处理的树脂,经过预处理后称重分别为2.2、2.1、2.3 g,计算得出吸湿率为10%。
2.2.3 吸附容量的测定 取1 g续断干膏制成100 mL水溶液,准确称取已处理过的大孔树脂6 g加入续断水溶液中,进行摇床,定时取样,进行香草醛反应,测定水溶液中皂苷的含量。根据取样时间和吸附量做吸附曲线,结果见表1、图1。
表1 取样时间和吸附容量
图1 取样时间和吸附量的吸附曲线图
结果表明其吸附时间主要在前9 h,在24 h达到饱和。同时也可以计算出大孔树脂对总皂苷的吸附量为55.6 mg/g。
2.2.4 大孔树脂的用量探索 取50 mL续断的水溶液放入已处理过的4 g大孔树脂中摇床24 h,过滤、将滤液水浴挥干,称重1 g,用甲醇定溶至10 mL。另取50 mL续断的水溶液,水浴挥干,称重1.3340 g,甲醇定容至10 mL,作为对照品。取样品和对照品各5 uL,进行香草醛反应,测定其吸光度,计算得到大孔树脂对总皂苷吸附量为60.2 mg/g,对生药吸附量为1.007 g/g。
2.3.1 对照品溶液的配置 精密称取黄芪甲苷标准品2.9 mg,用甲醇溶解并定溶于5 mL容量瓶中作为对照品溶液。
2.3.2 最大吸收波长的测定 分别取对照品溶液40 μL和总皂苷溶液40 μL进行香草醛反应显色后于紫外扫描测定,对照品和样品均在(532±2)nm处呈现最大吸收。
2.3.3 线性关系考察 分别取黄芪甲苷对照品溶液60、80、120、180、360 uL,水浴挥干溶剂,进行香草醛反应,于532 nm处测定吸收度,根据样品量(x)和吸收值(Y)可得回归方程y=15.297x-0.0517,R²=0.999。
2.3.4 精密度考察 精密吸取对照品溶液80 uL,进行香草醛反应,测定吸光度,并重复5次,结果表明精密度良好,RSD为0.75%。
2.3.5 显色稳定性的考察 取同一对照品80 uL,按项下操作显色后每隔20 min测定1次吸光度,结果表明,在显色后60~100 min之间吸收度很稳定(RSD=1.037%),但100 min后随着时间的延长,吸收度逐渐上升。所以测定应在显色后50~100 min之间进行。
将样品Ⅱ、Ⅲ分别加入已处理并填装好的大孔树脂柱中(湿法上样),依次用蒸馏水、30%、50%、70%、90%乙醇洗脱至Lieberman反应为阴性为止,收集不同浓度的乙醇洗脱液,浓缩至干,用甲醇定容。进行香草醛反应,测定结果见表2~3。
测定结果表明Ⅱ、Ⅲ样品的70%、90%乙醇洗脱部分基本不含三萜皂苷成分,而两者30%、50%乙醇洗脱部分共洗脱了91.03%、96.64%的皂苷,反映了其良好的解吸附能力。计算样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中总三萜皂苷的含量。结果见表4。结果表明,大孔树脂能够很好的富集续断中的总三萜皂苷。
续断是常用中药,其有效部分为三萜皂苷,但除三萜皂苷外,还含有较多的糖、蛋白质等杂质,影响皂苷的测定,从样品中除尽又比较困难。因此需要对续断中的总皂苷进行富集来排除其他因素的干扰。通常对于皂苷的富集采用正丁醇萃取法。由于此法的富集程度有限,作者决定探索一种更好的方法来解决该问题。结果找到了DM101型大孔树脂并结合正丁醇萃取来处理样品效果很好,不仅吸附快,解吸也快,对皂苷的吸附具有很好的选择性。
表2 样品Ⅱ不同浓度乙醇洗脱部分总皂苷的量
表3 样品Ⅲ不同浓度乙醇洗脱部分总皂苷的量
表4 样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中总三萜皂苷的含量
在使用树脂的过程中,需要探索乙醇洗脱的最佳浓度。本文通过使用30%、50%、70%、90%4种不同浓度的乙醇溶液洗脱至Lieberman反应为阴性为止,发现30%、50%的乙醇能洗脱掉90%以上皂苷,具有很强的解吸附能力,可作为总皂苷洗脱的最佳浓度。
对洗脱之后的样品挥干甲醇定容后便可进行含量测定。参考了文献资料后对总皂苷的含量通常采用比色法测定,可以消除杂质干扰。实验结果表明该方法精密度、重现性、稳定性均较好。
[1]Zhong JH,Li CS,Li DD.Progress in research of the active chemical components of Cornus off i cinalis[J].Zhongguo Xinyao Zazhi(Chin J New Drugs),2001,10(11):808-812.