32种中药水提取物的体外抗菌活性研究

曾富强，王 斌，李旭廷，李金良，詹素琼，袁定胜，梁 歌

（四川省畜牧科学研究院，四川 成都 610066）

随着抗生素的广泛应用，越来越多的病原菌对常用抗生素产生耐药性，且耐药程度日益加深。同时，由于化学合成药物开发的难度大、毒副作用明显，人们对从传统天然药物特别是中草药中寻找抗微生物感染的新药越来越关注。为了进一步发现更多的具有抗感染作用的中草药，探索其抗菌作用的物质基础，笔者此次对32种中草药水提取物抑制大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌的活性进行了筛选研究，现报道如下。

1 材料

1.1 中药 大力子、黄柏、牛蒡子、赤芍、连翘、麻黄、秦艽、黄连、穿心莲、马齿苋、紫苏子、牡丹皮、生地、苦参、山豆根、益母草、车前子、蒲公英、龙胆、大青叶、香薷、黄芩、白头翁、黄荆、千里光、薄荷、石斛、白芷、知母、栀子、青蒿、射干等32味中药饮片，均购自成都德仁堂药店。

1.2 菌株 3株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）由本实验室从临床病例中分离保存；金黄色葡萄球菌CVCC1882，大肠杆菌CVCC2801均购自中国兽医药品监察所。

1.3 培养基 MH琼脂和MH肉汤培养基（杭州天和微生物试剂有限公司生产）。

1.4 主要仪器 恒温培养箱，旋转蒸发仪、微量移液器等。

1.5 其他材料 96孔板。

2 方法

2.1 中药提取物的制备 采用传统水煎法。蒸馏水预先浸泡1h，加热煎煮2次，第一次保持微沸30min，滤出药液；药渣加温水再煮沸，仍保持微沸30min，滤出药液。合并2次滤液，用旋转蒸发仪浓缩至生药含量为1 g/mL。

2.2 细菌悬液的制备 将保存菌种接种于MH肉汤中，置于37℃恒温箱中复活16～24h。平板划线后倒置于37℃恒温箱中培养24 h。挑取3～5个菌落于装有生理盐水的试管，调整浑浊度至0.5麦氏比浊度（1～2×108CFU/mL）备用。

2.3 微量肉汤法测定32种中药提取物对金黄色葡萄球菌CVCC1882和大肠杆菌CVCC2801的MIC值 取无菌96孔板，分别于每一排的第一孔加中草药提取物（1g/mL）200μL，其余各孔均加入 MH肉汤100μL，于第一孔取100μL药液加入第二孔，充分混匀后再从第二孔取100μL于第三孔，以此类推，最后一孔不加药液，作为阴性对照。同时以青霉素作为阳性对照，浓度分别为：50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.3μg/mL、3.1μg/mL、1.6μg/mL、0.8μg/mL、0.4μg/mL、0.2μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL、0μg/mL。将稀释至0.5麦氏比浊度的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌标准菌悬液再稀释100倍，并分别加入加了药液的96孔板，每孔100μL。每排药液的最终浓度为：500mg/mL、250mg/mL、125mg/mL、62.5mg/mL、31.3mg/mL、15.6mg/mL、7.8mg/mL、3.9mg/mL、2.0mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0mg/mL。菌液加好后置无菌盒中，37℃恒温箱培养24h。

2.4 结果判定 在黑色背景的光源下与对照组孔（包括青霉素对照、肉汤对照）作比较，检测菌株的生长情况。若96孔板内肉汤呈混浊生长，孔底出现沉淀等判断为有菌生长；反之，澄清为无菌生长。无细菌生长孔所含的最低抗菌药物浓度即为MIC值（最低抑菌浓度）。

最后，筛选出具有较好抑菌活性的11种中草药提取物，用微量肉汤稀释法测定其对3株MRSA的MIC值，以标准金黄色葡萄球菌作对照。

3 结果

3.1 32种中草药提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌标准菌株的体外抑菌作用 结果见表1。32味中草药提取物中，对大肠杆菌标准菌株有抑菌作用的有19味，对金黄色葡萄球菌标准菌株有抑菌作用的有23味，同时对两者都有抑菌作用的有16味。对金黄色葡萄球菌抑菌较强的（MIC＜100mg/mL）中药提取物有大力子、黄柏、黄连、香薷、黄芩、千里光、薄荷、知母、栀子、青蒿、射干共11味，其MIC范围为3.9～62.5mg/mL；对大肠杆菌标准菌株抑菌较强的（MIC＜100mg/mL）中药提取物有香薷、黄芩和栀子共3味，MIC值均为62.5mg/mL。

3.2 11种中草药提取物对3株MRSA的体外抑菌作用 在32味中草药中筛选了对金黄色葡萄球菌有较好抑菌作用的11味中草药，分别对3株MRSA进行MIC值测定，结果见表2。与标准金黄色葡萄球菌对照组相比，除香薷外，3株MRSA对其余10味中草药提取物表现出了不同程度的耐药，其中对栀子、大力子和薄荷完全耐药；仅黄连、射干、黄芩、黄柏、香薷5味中药对3株MRSA同时表现出抑菌活性，但黄连、射干、黄柏与对照组相比，MIC值增加了2～4倍，仅香薷的MIC值减少2～4倍。

表2 11种中草药提取物对3株MRSA的MIC值测定

4 讨论

4.1 本试验选取的32味中草药粗提物中有24味表现出不同程度的体外抑菌效果，从表1统计结果得出，24味中药对金黄色葡萄球菌的抑菌效果普遍优于对大肠杆菌的抑菌效果，其中以黄连和黄柏对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，MIC值达到3.9mg/mL和15.6mg/mL。这与马翀（2008）和田应彪（2009）的研究结果一致。但本试验中黄芩对金黄色葡萄球菌的抑菌效果与田应彪的研究有一定差异，这可能是由于药物的产地、提取工艺等不同造成的。金黄色葡萄球菌与大肠杆菌由于细胞膜结构的差异，对不同种类的抗生素的敏感性也不同。这可能也是造成这两种菌对不同中药敏感性不同的主要原因。

4.2 挑选对金黄色葡萄球菌标准菌株MIC＜100mg/mL的11味中草药提取物，检测对3株MRSA的MIC值。表2结果显示，3株MRSA对10味中药均表现出一定的耐药性，MIC值增加了2～4倍，且对栀子、大力子和薄荷完全耐药。目前，细菌对抗生素的耐药性引起了世界范围内的广泛关注，而本试验发现MRSA对中草药也会产生耐药性。可以推测，耐药菌的耐药性除了具有特异性外，还具有非特异性。即对任何危害其生存的因素都有一定的抵抗力，在药物及环境压力的自然选择作用下，加快了细菌的这种非特异性抵抗力的进化速度，使得这种能力越来越强，如细菌细胞膜渗透性有所改变，细菌对药物主动外排功能增强等。这种非特异性的耐药性将为人类防治细菌性疾病提出更大的挑战。

4.3 本试验发现香薷的水煎剂对MRSA的MIC较对金黄色葡萄球菌标准菌株的MIC减少2～4倍，提示该药物对MRSA有独特的作用机制。本试验为下一步进行该药物水煎剂抑菌成分的分析，作用机理研究及MRSA治疗药物的研制打下了基础。

[1]陈秀枢.微量肉汤稀释法测定MIC的评价[J].中华医学检验杂志，1994，17（2）：95-98.

[2]马翀，齐长明，王亨，等.20种中药对奶牛乳房炎病原菌抑菌效果比较[J].中国兽医杂志，2008，44（8）：55-57.

[3]田应彪，陈泽慧，杨名慧，等.16种中药水煎液对MRSA和MSSA体外抑菌试验观察[J].中国医院药学杂志，2009，29（11）：897-899.