胃宁胶囊对胃溃疡大鼠胃黏膜EGF及EGFR mRNA表达的影响

刘敬，赵斌，王琼，谢朝良

胃溃疡是消化系统常见疾病，胃宁胶囊用于脾胃气虚、肝胃不和所致的胃脘疼痛、喜按、呕吐酸水、胃溃疡及胃痛见上述症候者。前期药效学实验表明胃宁胶囊具有很好的抗溃疡作用，本实验通过研究胃宁胶囊对大鼠胃黏膜EGF及EGFR mRNA表达水平的影响，探索其抗溃疡的作用机理。

1 实验部分

1.1 药品与动物

胃宁胶囊（规格：0.4 g/粒，由成都中医药大学制剂教研室提供，批号：100301、100302、100303，三批等量混合使用）；大鼠，SD种，普通级，体重170.2～190.9 g，雌雄各半（由成都中医药大学实验动物研究中心提供，动物质量合格证：SCXK(川)2008-11号）。

1.2 统计方法

各组数据均用x±s表示，采用spss11.5统计软件进行处理。

1.3 实验方法[1]

1.3.1 造模 取健康SD大鼠24只，雌雄各半，按性别随机搭配分成3组，每组8只，分别作为：①模型对照组：纯净水1 mL/100 g体重；②胃宁胶囊治疗组：0.6 g.kg-1(浓度为0.06 g.mL-1，给药容量均为1 mL/100 g体重)。 ③正常对照组：正常饲养。①、②组动物灌胃给药，每天1次，第5天给药后禁食不禁水48 h，第7次给药后4 h, 将大鼠在乙醚麻醉下剖腹，于幽门和十二指肠交界处结扎，将大鼠行幽门结扎性胃溃疡模型，禁食禁水，19 h后放血处死大鼠，取胃黏膜。实验用器械均以0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的器械消毒液浸泡12 h以上，玻璃器皿则干烤200℃ 5 h以上，灭活RNA酶。正常对照组于腺胃前壁近幽门处，其余各组沿溃疡周围取下约1×1 cm2大小的胃壁，冰生理盐水冲洗干净，用无菌滤纸小心拭干，迅速放入液氮中冷存，用RT-PCR检测胃黏膜组织EGF及EGFR mRNA的表达水平。

1.3.2 总RNA的提取与定量 分别取大鼠胃黏膜，约100 mg置加有1 mLTrizol 裂解液的无菌离心管中，电动匀浆器匀浆，吸取组织裂解液加到1.5 mL无菌EP管中，室温放置5 min，Trizol试剂盒法确定总RNA的质量及纯度。

1.3.3 单链cDNA的合成 按照RT-PCR一步法扩增试剂盒方法，分别以胃黏膜组织总RNA为模板进行RT-PCR扩增。各目的基因的引物序列、产物大小如下: 大鼠EGF特异性引物正义链：5′–TCG GTG CTG TGC GAT TTA–3′，反义链：5′–TGG TGG GCA GGT GTC TTT–3′，扩增片断长度为367bp；大鼠EGFR特异性引物正义链：5′–AGC GAG GCT GAC AAG AAG A–3′，反义链：5′–CAC CCG CAC CCT GAT ACA–3′，扩增片断长度为378bp。内标参照管家基因GAPDH(glyceraldehyde–3–phosphate dehydrogenas)正义链：5′–ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC–3′，反义链：5′–TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA–3′，扩增片断长度为485bp。RT-PCR反应体系为25 μL，包括0.5 μg.μL-1总RNA 1μL，10×Taq酶缓冲液2.5 μL，dNTPs 2.5 μL，MgCl25 μL, Taq酶、AMV、Inhibitor各0.5 μL，GAPDH引物、EGFR引物各1 μL，溶于8 μL无RNA酶去离子水中。反应条件为：取RT-PCR产物7 μL，以DL2000为Marker, 经

1.5%琼脂糖凝胶90 V电泳30 min，0.5 mg.mL-1溴乙锭溶液染色，凝胶成像分析。以GAPDH作为内参照，计算机灰度扫描求积定量，用目的基因条带与

GAPDH灰度比值表示EGF及EGFR mRNA表达水平。

1.4 实验结果

1.4.1 胃宁胶囊对EGF mRNA的影响 与正常组比较，模型组及胃宁胶囊组大鼠胃黏膜组织对机体保护作用的EGF mRNA的表达水平较正常组明显上调(P<0.01)；与模型组比较，胃宁胶囊组EGF mRNA表达水平明显上调(P<0.01)。结果见表1。

1.4.2 胃宁胶囊对EGFR mRNA的影响 与正常组比较，模型大鼠胃黏膜组织对机体保护作用的EGFR mRNA的表达水平较正常组上调，但无统计学意义(P＞0.05)，胃宁胶囊组大鼠胃黏膜组织对机体保护作用的EGFR mRNA的表达水平明显上调(P<0.01)；与模型组比较，胃宁胶囊组EGFR mRNA表达水平明显上调(P<0.05)。结果见表1。

表1 胃宁胶囊对胃溃疡模型大鼠胃黏膜EGF及EGFR mRNA表达水平的影响 ( x±s)

2 结论

胃宁胶囊能显著提高大鼠胃黏膜中EGF及EGFR mRNA表达水平，提示其抗溃疡作用与细胞因子的介导有关。

3 讨论

消化性溃疡是临床常见多发性疾病，现代医学认为溃疡发生是黏膜侵袭因素和防御因素失衡的结果。文献报道，中药对实验性胃溃疡的作用机制主要从减弱胃溃疡的攻击因子、增强胃黏膜防御因子和改善中枢神经功能的传导等方面起作用。本实验从胃宁胶囊对大鼠胃黏膜EGF及EGFR mRNA表达水平影响来探讨其抗溃疡的作用机理。

EGF在维持胃肠黏膜完整性、保护胃黏膜免受损伤因子破坏方面起着非常重要的作用[2～3]，对胃溃疡的发生、发展和愈合均有影响。 EGF是一种有效的促分裂素，其主要功能是促进细胞增生，参与胃肠上皮细胞的增生、成熟、分化，在生理条件下调节胃肠道的生长发育。此外EGF具有营养和保护胃肠道作用。黏膜损害和HP（幽门螺杆菌）感染时胃黏膜EGF蛋白水平和EGFR mRNA的表达水平增加，而唾液中的EGF的浓度不受影响[4]。溃疡发生后EGF等生长因子表达水平上调可以促进再生黏膜细胞迁移进入新生肉芽组织，修复黏膜疤痕中腺体结构[5]，刺激黏膜和/或重碳酸盐分泌，增加局部血流量，以及释放多种细胞保护因子[6]。EGF是近年发现的在细胞增殖和分化中起重要作用的分子[7]，更是再生黏膜功能成熟度的重要指标。

EGFR对EGF有高度特异性和亲和力，广泛存在于多种上皮细胞膜上。当EGF到达靶细胞表面时，很快与细胞膜上EGFR结合，诱导其变构，形成受体二聚体，激活受体膜内区域的酪氨酸蛋白激酶，使自身的一系列酪氨酸被磷酸化，调节细胞生长与分化。

本研究采用了RT-PCR技术，探讨了胃宁胶囊对EGF及EGFR mRNA在胃溃疡大鼠胃黏膜中表达的干预作用。实验结果显示经幽门结扎造模损伤后，模型大鼠胃黏膜组织应激刺激，对机体保护作用的EGF及EGFR mRNA的表达水平与正常对照组相比明显上调，而胃宁胶囊处理后EGF及EGFR mRNA表达水平进一步上调，胃宁胶囊可明显增强胃溃疡边沿上皮EGF及EGFR mRNA的表达，提示胃宁胶囊的抗溃疡机制可能通过激活EGF/EGFR系统，增强胃黏膜的保护作用，而促进溃疡愈合。

[1] 谢秀琼主编.中药新制剂开发与应用[M].北京:人民卫生出版社,2006:440.

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[3] 陈蔚文,李茹柳,徐颂芬,等.加味左金丸抑酸止痛作用的临床观察及实验研究[J].中药药理与临床,1995(6):45.

[4] 刘伟.EGF与胃肠关系新进展[J].国外医学消化系疾病分册,2002,22(4):207.

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[7] 傅智敏,朱曙东.香砂六君子汤对大鼠急性胃黏膜损伤的保护作用[J].浙江中医学院学报,2000,24(4):52.