SPE-HPLC法同时测定大白菜中吡虫啉等5种农药残留方法研究

李志坚

（1.湖南省农科院农产品加工研究所，湖南 长沙 410125；2.湖南省食品测试分析中心，湖南 长沙 410125）

吡虫啉、多菌灵、灭幼脲、除虫脲、辛硫磷5种农药是蔬菜水果生产中应用比较广泛的低毒型农药，这些农药残留在蔬菜或水果上，被人或其他高等动物长期食用后，会在人体或动物体内蓄积起来，引起慢性中毒[1]。对这5种农药的残留检测方法报道很多，例如在黄瓜、毛豆、大蒜等中的吡虫啉残留量检测[2-4]，在芦荟、苹果汁中的多菌灵检测[5-6]、在白菜中的灭幼脲残留检测[7]、在小麦中的除虫脲残留量测定方法[8]；在玉米、大蒜中的辛硫磷检测方法等[9-10]。其中，除辛硫磷是用气相色谱法检测外，其余4种农药残留均常用高效液相色谱方法来测定。但到目前为止，还没有只用一种方法就能同时检测这些不同类型农药的残留量的报道。而在实际农业生产中，在低毒农药中掺加禁用农药或者多种农药混合施用的现象十分普遍，因此研究一种简单快速的分析方法能同时检测这些不同类型的农药，为相关检测机构的农残检测提供参考，为无公害蔬菜的生产提供技术支撑。

l 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试药剂 供试样品为大白菜（湖南省农科院菜市场）；吡虫啉、多菌灵、除虫脲、灭幼脲、辛硫磷标准品，浓度均为100μg/mL（农业部环境保护科研监测所）；甲醇和乙腈（TEDIA，HPLC级），Na－Cl（分析纯），实验用水为Millipore 18.2MQ·cm的高纯水（下文中简称水）。

1.1.2 试验仪器 LC-20A液相色谱系统：配备二元高压梯度泵、PDA检测器，柱温箱，自动进样器及LC-Solution色谱数据处理工作站等（日本Shimadzu公司）；Phenomenex C18高效液相色谱柱（5μm，250 mm×4.6 mm）；氮吹仪（MTN-2800D）；固相萃取装置（VNW Technologies GmbH），SUPELCO NH2小 柱（500 mg/6mL）；FJ-200高速分散均质机。

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理（1）提取。向25 g白菜样品中加入50 mL乙腈，高速匀浆3 min后，过滤至装有7～8 g氯化钠的具塞量筒中，加塞剧烈振荡2 min，静置分层。吸取上层提取液10 mL，放入50 mL梨形瓶中，于40℃旋转蒸发至近干，加入4.0 mL（甲醇+二氯甲烷）混合液（1+99）溶解残渣，盖上铝箔，待净化。（2）净化。将氨基柱（83.3 mg/mL）用5.0 mL（甲醇+二氯甲烷）混合液（1+99）充分活化，将上述待净化液上柱，用20 mL刻度试管接收洗脱液，用6 mL（甲醇+二氯甲烷）混合液（1+99）分两次充分洗涤梨形瓶，依次过柱，收集洗脱液。将试管置于氮吹仪上吹至近干，用甲醇准确定容至2.5 mL，于旋涡混合器上混合均匀后用0.45μm有机滤膜过滤，上液相色谱仪检测。

1.2.2 色谱条件优化 色谱柱温为40℃，进样量20μL。针对波长、流动相、流动相流速3个方面进行优化，选取200～400 nm波长范围进行扫描来确定检测波长；选择甲醇+水、乙腈+水、甲醇+乙腈+水3种流动相，设定0.5、0.8、1.0、1.5 mL/min 4个流动相流速进行洗脱，最后根据色谱结果来确定最佳色谱条件。

1.2.3 标准曲线的绘制 准确分别吸取10μL的吡虫啉、多菌灵、除虫脲、灭幼脲、辛硫磷标准品（100μg/mL），用甲醇定容至1.0 mL，配制成1μg/mL的单一农药标准使用液。准确吸取3、5、10、50、100μL的5种农药标准品（100μg/mL），分别定容至10 mL，配制成0.03、0.05、0.1、0.5、1.0μg/mL混合标准工作溶液。按最佳色谱条件进行测定，绘制标准曲线。

2 结果与分析

2.1 波长的选择

二极管阵列检测器在200～400 nm范围内的吸收光谱扫描结果表明：吡虫啉最大吸收波长为270 nm，多菌灵和辛硫磷在280 nm处均有较大吸收，除虫脲和灭幼脲在254 nm处有较大吸收，但由于254 nm是大多数含有苯环结构的化合物的特征吸收波长，干扰相对较大，而在270 nm处5种目标物均有较大吸收，因此对于单波长检测器，可选择270 nm处作为检测波长。

2.2 流动相的选择

为达到经济、快速、准确的目的，以及令人满意的分离效果，选择了甲醇+水、乙腈+水、甲醇+乙腈+水作为流动相分别进行试验，结果表明：以甲醇+乙腈按3+1比例混合作为有机相，与水一起进行梯度洗脱，分离效果较为理想。利用乙腈和甲醇在分离选择性上的不同解决了不同成分的分离（甲醇和乙醇是质子性，乙腈和四氢呋喃是非质子性），起到了减小柱压、提高分离度、改善峰型的作用。

2.3 流动相流速的选择

流动相流速较大虽能缩短分析时间，但会导致5种目标物得不到理想的分离，或者与杂质一起出峰，从而影响积分的准确性；流速过小则会使分析时间加长，不能获得理想的峰形。因此，从分离度、仪器稳定性和峰形等综合考虑，通过不同流速进行试验，寻找最佳流速。试验结果说明，当流速为1.5 mL/min时出峰较早，导致目标峰与杂质峰重叠产生干扰；当流速为0.5 mL/min时，出峰时间推迟，能与杂质峰完全分开，但不能获得理想的峰形；当流速为1.0 mL/min时，5种农药在20 min之内达到完全分离，而且能够获得较好的峰形，因此确定1.0 mL/min为最佳流速。

最佳色谱条件：柱温为40℃，进样量为20μL，检测波长为270 nm，流动相为水与甲醇+乙腈混合液（3+1），流速为1.0 mL/min。采用梯度洗脱，具体操作见表1。通过保留时间定性，外标法定量。5种农药混标溶液的色谱图见图1，大白菜样品色谱图见图2。

表1 流动相梯度洗脱程序

图1 5种农药混合标准溶液色谱图

图2 大白菜样品色谱图

2.4 线性范围和方法检出限

在最佳色谱条件下，取系列浓度的混合标准工作液进行色谱测定，由数据处理工作站直接制作校准曲线、回归方程及相关系数（见表2）。从表2中可知：5种农药检测的线性回归方程的相关系数均大于0.99，最低检出限在0.020～0.030μg/L。

表2 5种农药的线性范围、线性回归方程、相关系数和检出限

2.5 回收率与精密度检验

为了验证方法的可靠性，进行了回收率试验。取5份大白菜样品，分别加入已知量的吡虫啉、多菌灵、除虫脲、灭幼脲和辛硫磷标准溶液，按最佳色谱条件重复测定5次，色谱图见图3，结果见表3。从表3可知，5种农药的平均回收率在88.5%～98.8%之间，相对标准偏差在1.84%～4.62%之间。

表3 5种农药的回收率和相对标准偏差

图3 加标试样色谱图

3 结论

该试验采用固相萃取-高效液相色谱法同时检测大白菜中吡虫啉等5种农药残留量。从5种农药的回收率、变异系数和最低检出限可以看出，该方法的准确度和精密度均较高，而且操作较简单，便于推广应用，适用于大部分蔬菜中吡虫啉等5种农药残留量的测定，是可以满足现代社会需求的简便、快速、灵敏、准确的多种农药残留同时检测的方法。

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