姜黄素对BLM诱导的肺纤维化模型大鼠CTGF表达的影响

薛爱芹，王稳，李银生

（菏泽医学专科学校,山东 菏泽 274000；菏泽开发区中心医院；新乡医学院）

姜黄素对BLM诱导的肺纤维化模型大鼠CTGF表达的影响

薛爱芹，王稳，李银生

（菏泽医学专科学校,山东 菏泽 274000；菏泽开发区中心医院；新乡医学院）

目的观察博莱霉素诱导的大鼠肺间质纤维化模型中肺内结缔组织生长因子表达的变化，探讨姜黄素对肺纤维化大鼠肺组织内结缔组织生长因子表达的影响及姜黄素对肺间质纤维化的干预作用及其可能的机制。方法建立博莱霉素诱导的大鼠肺间质纤维化模型。将健康雄性昆明大鼠96只，随机分为4组，每组24只，分别为空白对照组、模型组、阳性药物对照组和姜黄素干预组。模型组、阳性对照组和姜黄素干预组均一次性滴入博莱霉素（气管内给予5mg/kg）制作肺纤维化动物模型，空白对照组以同样方法一次性气管内注入等体积的生理盐水。造模后第1天，姜黄素干预组给予姜黄素200mg/kg/d，阳性对照组给予醋酸泼尼松0.56mg/kg/d，空白对照组和模型组每天分别灌服等体积的生理盐水。各组大鼠分三批分别在造模7d、14d、28d时随机处死8只，取肺组织：1）行病理切片进行HE染色，观察肺组织肺泡炎程度和肺纤维化情况。2）进行免疫组织化学技术，结合图像分析来检测各组肺组织中结缔组织生长因子蛋白的表达情况。结果空白对照组大鼠结缔组织生长因子表达低微，模型组大鼠结缔组织生长因子的表达水平较空白对照组的正常肺组织明显上升（P<0.01），且与肺纤维化的程度显著相关。姜黄素干预组大鼠和阳性对照组大鼠肺组织中的结缔组织生长因子的表达与模型组大鼠相比明显降低，其差异有统计学意义（P<0.01），但仍高于空白对照组。结论证明了姜黄素对博莱霉素诱导的大鼠肺间质纤维化具有明显的防治作用，其机制可能是通过抑制结缔组织生长因子在肺组织中的表达来实现的。

姜黄素/治疗作用；肺纤维化模型；结缔组织生长因子

肺纤维化（pulmonary fibrosis，PF）一般是指在感染、毒物、药物、严重的外伤、自发免疫反应等不同外源或内源因素刺激下引起肺部炎症反应，肺泡持续性损伤,细胞外基质反复破坏、修复、重建并过度沉积，导致正常肺组织结构改变、功能丧失的一类疾病[1]。患者主要表现为逐渐加重的呼吸困难，伴有刺激性干咳，病情一般持续发展，最终因呼吸衰竭而死亡。预后差，确诊后平均生存时间2～3年，患者确诊后5年病死率达到65%[2]。美国的一项调查显示18～34岁人群的特发性肺间质纤维化（idiothomeol pulmonary fibrosis，IPF）患病率约为7/10万，75岁以上人群的IPF患病率为227.2/10万，年发病率约为1.2～76.4/10万[3]。其病因和发病机制尚不清楚，目前还是个世界性难题。通过动物实验和临床研究已表明，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、结缔组织生长因子（CrGF）、血小板源性生长因子（PDGF）、转化生长因子-β（TGF-β）、IL-1、IL-6等分泌产生的细胞因子，在肺纤维化的形成过程中有促进作用。

姜黄素是从姜科姜黄属植物的根茎中提取的一种天然有效成分。目前姜黄素用于抗肝纤维化作用的研究已比较多见，用于抗肺纤维化的研究处于起步阶段，其作用机理比较复杂，有待实验进一步阐明。本实验是进一步深入研究其发挥作用的机制及途径。现将实验及结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性昆明大鼠96只，体重20g±2g，由郑州大学医学院实验动物中心提供，生产许可证号：CXK（豫）2005-0001。

1.2 主要实验试剂 SABC二抗试剂盒、DAB显色试剂盒、兔抗鼠CTGF多克隆抗体等均购自武汉博士德公司。

1.3 动物造模 腹腔注射10%水合氯醛（2.5mL/kg）麻醉大鼠后，将其仰卧固定在操作台上，用碘伏、酒精消毒颈部皮肤后，用手术刀依次逐层分离，直至显露气管。然后拿注射器朝向心端经气管软骨环间隙刺入气管，缓慢推入事先准备好的0.3mL博莱霉素生理盐水溶液（博莱霉素按5落石出mg/kg比例溶于0.2～0.3mL生理盐水中）或等体积的生理盐水溶液，继续注入0.3mL的空气，注入后立即将大鼠直立并左右来回旋转，目的是使药液尽量在双肺内均匀分布。

1.4 分组、给药和取材 健康SD雄性大鼠随机分为4组：空白对照组（A组）（气管内注入0.3mL生理盐水）、模型组（B组）、阳性药物对照组（C组）和姜黄素干预组（D组），每组24只。SD大鼠造模后第1天，分别给各组大鼠生理盐水、醋酸泼尼松、姜黄素。醋酸泼尼松片在使用时需配成混悬液，用蒸馏水溶解即可。姜黄素在使用时也需配成混悬液，用0.5%羧甲基纤维素钠溶解即可。其中A组、B组大鼠分别每天给予剂量为0.014L/(kg·d)的生理盐水，C组大鼠每天给予剂量为0.56mg/(kg·d)的醋酸泼尼松混悬液，D组大鼠给予姜黄素羧甲基纤维素钠混悬液，每天剂量为200mg/(kg·d)。分3次分别在造模的7d、l4d、28d后给大鼠取材，各组每次随机处死8只，共32只。具体步骤为：大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉（2.5mL/kg）后将大鼠固定，腹主动脉放血处死大鼠，快速开胸取肺脏，冷生理盐水清洗后，置于-70℃冰箱冻存备用。

1.5 肺组织病理学检查 取肺组织，按常规病理学方法进行固定，包埋，切片。将病理切片进行苏木素一伊红（HE）染色。

1.6 免疫组化染色 常规脱醋，PBS洗涤，过氧化氢3%孵育，PBS洗涤，标记二抗，PBS漂洗后DAB显色，自来水充分冲洗，复染，脱水，烘干，封片。胞质内出现棕黄色颗粒为阳性反应。半定量图像分析：将肺组织各时点切片，随机取染色区域5个高倍视野（×400），测量并记录每个视野阳性染色的平均积分光密度值（integrated optical density，IOD），并根据得出的数据资料进行统计分析。

2 结果

2.1 大鼠一般状态 在实验时间段内，A组大鼠饮食量、活动性及大小便无明显变化，皮毛光泽发亮，体重逐渐增加，呼吸平稳。B组大鼠均逐渐出现饮食量减少及活动性差，时有稀便，皮毛凌乱干枯，缺乏光泽，精神不振，反应迟钝、呼吸急促。C组和D组大鼠随着用药时间的延长，进食量、摄水量增加，活动逐渐恢复，大便偶有稀便，皮毛稍凌乱有光泽，精神状态亦随之好转，呼吸逐渐转平稳。C组和D组大鼠的一般状态不如A组大鼠，但显著好于B组大鼠。

2.2 HE染色结果 病理组织学改变HE染色显微镜观察可见：A组大鼠在7d、14d和28d时肺组织结构未见异常。B组大鼠7d时肺组织以肺泡急性炎症为主，毛细血管充血扩张，肺泡腔内可见积液，肺泡间隔水肿增宽；14d和28d时大量肺泡结构萎陷、破坏，胶原沉积，成纤维细胞增生，肺泡结构紊乱，间隔纤维化显著。该模型中大鼠肺组织经历了一系列的病理变化，形成了稳定的肺纤维化。在7d、14d和28d时C组的肺组织纤维化情况有所好转，部分细支气管及肺泡内可见炎性细胞，散在的。与B组相比，肺泡间隔窄，纤维病灶可见于周围支气管，增厚的胸膜，程度较轻的纤维化。D组在7d、14d和28d时肺组织纤维化情况明显好转，肺泡内未见明显的炎性细胞，肺泡间隔纤维增生灶较少。细支气管周围的纤维化程度明显低于模型组。

2.3 免疫组化检测CTGF的表达变化

表1 不同时间点肺组织中CT-G F表达的免疫组化染色检测结果（平均光密度值）（±s）

表1 不同时间点肺组织中CT-G F表达的免疫组化染色检测结果（平均光密度值）（±s）

*与空白对照组组相比P<0.01，△与模型组B组相比P<0.01。

组别 n 7d 14d 28d A 组 80.08±0.020.07±0.020.07±0.01B组 80.15±0.02b 0.27±0.03b 0.38±0.03*C组 80.10±0.02△ 0.20±0.02△ 0.25±0.03△D组 80.11±0.02△ 0.21±0.03△ 0.22±0.02△

分析上述结果我们可以得到：1）B组在灌注BLM后28天CTGF表达水平达到高峰。B组7d、14d、28d肺组织CTGF的表达较A组有显著性差异（P<0.01）。2）与B组相比较，C组和D组都能够明显降低肺组织CTGF表达，但两者比较无显著性差异。

3 讨论

肺纤维化（Pulmonary fibrosis，PF）是多种已明确或未明确的原因导致患者最终以呼吸衰竭而死亡的慢性肺部疾病的共同结局。其病因和发病机制尚不清楚，被称为“不是癌症的癌症”。主要病理特点传统理论认为炎症过程占很重要的作用，即肺部的炎症导致肺的损伤和肺的纤维化，然而，经过若干年的研究，很少有证据证实以上的观点[4]。因而，近些年来的研究不再仅仅局限于炎症，研究显示各种原因引起的肺泡上皮细胞的损伤源于多种致纤维化细胞因子，如结缔组织生长因子（CTGF）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、肿瘤坏死因子α（TNFα）、血小板源性生长因子（PDGF）、白细胞介素-1（IL-1）等。由此可见，PF的治疗目标应由传统的单独抗炎转变为抗细胞因子的治疗等措施。大量实验研究表明，姜黄素具有此作用，具有良好的临床应用潜力。

3.1 大鼠肺纤维化模型的建立 建立良好的大鼠肺纤维化模型是进行本研究的基础。目前用于PF治疗药物研究的肺纤维化模型有很多种，百叶枯诱导的肺纤维化模型；胺碘酮诱导的肺纤维化模型；二氧化硅诱导的肺纤维化模型；石棉诱导的肺纤维化模型；放射源诱导的肺纤维化模型等。最常使用的为博莱霉素气管内给药诱导肺纤维化模型，因为该制备方法所得模型的病理组织学改变与人类肺纤维化的病理改变最为相似[5]。常用诱导方法有：博莱霉素诱导的肺纤维化模型，给药途径有气管内给药、经鼻给药、静脉注射、腹腔注射等。博莱霉素系自轮状链丝菌培养液中提取的一种碱性水溶性糖肽类抗肿瘤抗生素，含有13种组分的复合物，具有广谱抗癌作用。其不良反应之一为肺毒性，对肺组织的持续损伤可致最后阶段的肺间质纤维化。其机制可能是：BLM被认为是一种金属螯合物，能与Fe2+形成BleomycinFe2+复合物，这一复合物能为氧分子（O2）提供电子，形成过氧化物和羟基，正是这些高度活性的中间产物最后破坏DNA，引起DNA分子断裂。在肺组织的正常细胞内代谢BLM的酶活性低，BLM在肺组织的积聚增多，以致肺的损伤。本研究显示：A组大鼠在7d、14d和28d各时期肺支气管和肺泡结构正常；B组大鼠7d时炎症细胞聚集于肺泡腔和肺泡间隔，肺泡腔缩小，肺泡间隔增厚；14d时肺泡腔和肺泡间隔的炎性细胞渗出减轻，肺泡间隔增厚，可见增多的成纤维细胞；28d肺泡结构破坏，纤维化稳定，并且十分典型明显，与文献报道一致，证明造模成功。

3.2 姜黄素对大鼠肺纤维化中CTGF表达的影响结缔组织生长因子（CTGF）是近年来发现的一种重要的促纤维化细胞因子，不仅可以直接刺激成纤维细胞增殖和细胞外基质合成增加，还可以专一介导TGFβ的促纤维化作用。事实上TGFβ促进脏器纤维化的信号是通过CTGF向下转导的[6]。而CTGF作为TGFβ的下游效应介质，其生物学功能有:1)促进细胞增殖，合成胶原。2）调节细胞外基质基因的表达。3）介导细胞黏附。4）刺激细胞迁移。5）促进血管形成等。

本实验利用免疫组化方法结果显示：CTGF在A组大鼠的肺组织中几乎不表达，而在B组大鼠的肺组织中，CTGF蛋白的表达明显升高，而且CTGF的表达随着大鼠肺纤维化程度的加重逐渐增高，提示CTGF在肺纤维化的形成过程中起重要作用[7]。D组大鼠的肺组织CTGF蛋白的表达有一定程度的降低，与B组比较，有统计学差异，这说明姜黄素能够从蛋白水平调节肺组织CTGF蛋白的活性。

本研究初步探讨了姜黄素抗肺纤维化的作用以及作用机制，也为临床新药的开发提供了一种新的思路。另外该药具有毒性低、价格低、药源充足等优点，具有良好的开发应用前景。肺纤维化的形成是一个复杂的过程，进一步的实验研究与临床研究工作还需更加艰辛的努力。

[1]李丽娜，王华，周蕾，等.博莱霉素诱导小鼠肺间质纤维化造模方式的选择[J].中国免疫学杂志，2010，26（4）：254–257.

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R332

A

1008-4118（2012）03-0001-03

10.3969/j.issn.1008-4118.2012.03.

菏泽医学专科学校基金研究课题，项目编号:H11K08。

李银生：E-mail：yinshengli@xxmu.edu.cn.

2012-03-19