基于TaqMan探针的猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒实时荧光定量PCR方法的建立＊

祝秀梅，马全英，杜 平，王 凡，吕志慧，牟克斌

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒 （Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）于1987年首先出现于美国［1］，由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起。其症状主要表现为怀孕母猪流产、早产、死胎、木乃伊胎及仔猪感染后的成活率下降。PRRS的一显著特性是具有高度传染性，1987年在北美首次爆发后，迅速在全球蔓延［2－3］，给畜牧业的发展带来了严重的危害。十多年来，因它给世界养猪业造成巨大经济损失而引起了科学界的关注。2006年在我国暴发的高热病，给我国的养猪业带来巨大的破坏，由于诊断不及时，未做好应对工作，使许多中小型猪场因此倒闭，养殖户损失惨重［4－5］。因此建立快速有效实用的诊断方法是防制PRRS流行的重要环节。目前的诊断方法存在操作复杂费时、灵敏度或特异性不强等缺点。普通RT-PCR易出现假阳性，且核酸染色剂（溴化乙锭，EB）对人体健康有很大的危害。

实时荧光定量PCR（Real-time PCR）具有敏感性和特异性高、重复性和稳定

性好、耗时短、无污染的特点，已成为核酸定量检测的首选方法而得到广泛应用［6－8］。本研究选用PRRSV中的最保守的ORF7基因，设计引物和探针，建立了检测PRRSV的TaqMan实时荧光定量PCR，并对体系进行了优化。分别进行特异性、敏感性、稳定性试验，并对临床样品进行检测，建立了可准确、快速检测PRRSV的方法。

1 材 料

1.1 毒株 PRRSV SY0608细胞毒均由本实验室分离、鉴定并保存PCV-2、CSFV、HCV、PRV、PPV细胞毒均为本实验室保存；临床样品采自周边地区猪场。

1.2 试剂与仪器 病毒基因组RNA提取试剂盒购自 QIAGEN 公司，Premix ExTaqTM、T4DNA ligase、反转录试剂盒、Ex-Taq聚合酶、pMD-18T、DNA Marker等均购自TaKaRa（大连）公司；DNA胶回收试剂盒购自Promega公司；荧光定量PCR仪为StrataGen公司产品（Mx3000P）。

1.3 引物的设计与合成 根据GenBank上下载的PRRSV基因组全序列进行比对，找出PRRSV ORF7相对保守的区域，设计一对引物和探针，并送至宝生物工程（大连）有限公司合成。引物、探针序列如下。

2 方 法

2.1 标准阳性模板的制备

2.1.1 ORF7基因的扩增 按照QIAGEN RNA提取试剂盒说明书，从PRRSV感染的细胞培养物中提取病毒全基因组RNA，用宝生物反转录试剂盒中的Oligo（dT）进行反转录，合成cDNA。以cDNA为模板，用PRRSV上、下游引物扩增PRRSV ORF7基因，扩增条件为：94℃4min；94℃1min，58℃45s，72℃1min，共35个循环；72℃8min。反应结束后取8μL PCR产物经10g/L的琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。

2.1.2 ORF7基因的克隆与鉴定 将扩增出的ORF7基因按胶回收试剂盒说明回收后与pMD-18T载体连接，转化工程菌DH5α感受态细胞，通过抗性筛选挑取单菌落，接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜至液体混浊，用小量质粒提取试剂盒提取质粒，并分别进行酶切鉴定。将鉴定正确的重组质粒送至上海生工生物工程有限公司测序。

2.1.3 标准阳性模板的稀释 用紫外分光光度计分别测定阳性重组质粒的OD260和OD280，并计算浓度与拷贝数。将重组质粒进行10倍梯度稀释后作为标准阳性模板，用于荧光定量PCR反应条件的优化和标准曲线的建立。

2.2 不同探针浓度对扩增产物量的影响 本试验采用TaKaRa公司的Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）system，是优化好的含有酶、dNTP、Mg2＋等成分的2×预混液，按照试剂盒操作说明书进行操作。采用25μL反应体系，其中Premix Ex TaqTM12.5μL，PRRSV上、下游引物各0.5μL，RoxⅡ0.5μL，108拷贝/μL的重组质粒1μL；探针浓度依次为0.05μmol；0.1μmol；0.2μmol；0.3 μmol；0.4μmol；0.5μmol 0.5μL，补足水至25μL。混匀后进行PCR扩增，反应程序按宝生物Premix Ex TaqTM中推荐的程序进行：95℃30s，95℃5s、60℃20s循环40次。同时设立无模板的阴性对照。

2.3 荧光定量PCR反应标准曲线的建立 利用经优化后的PRRSV探针浓度，应用相同的反应程序，对10倍系列稀释的PRRSV阳性标准模板进行扩增，收集荧光数据，建立标准曲线。

2.4 荧光定量PCR的敏感性试验 取以10倍梯度稀释的标准阳性质粒作为模板并用无RNA酶水设阴性对照分析敏感性，以优化的反应体系和条件进行荧光定量PCR反应。

2.5 荧光定量PCR的特异性试验 以PRRSV 108、107、106、105、104拷贝/μL的阳性质粒以 及PCV-2、CSFV、HCV、PRV、PPV病毒核酸为模板，按照优化的条件进行荧光定量PCR检测，以检测本方法的特异性。

2.6 荧光定量PCR的重复性试验 以109、108、107拷贝/μL的重组质粒作为标准阳性模板，每个浓度重复3次，按照优化的扩增体系进行荧光定量PCR，计算变异系数（CV%），以评价本方法的准确性和稳定性。

2.7 临床样品的检测 采集来自周边猪场的30份组织样品，提取RNA，用建立的该方法及常规PCR法对上述组织样品进行检测，同时用细胞培养来进行病毒分离，分离的病毒用普通RT-PCR进行扩增。

3 结 果

3.1 ORF7基因的扩增、克隆及鉴定结果 扩增出的ORF7基因RT-PCR产物大小为105bp，与预期结果相符。扩增产物连接到pMD-18T载体上，得到的重组质粒命名为pMD-ORF7。经双酶切鉴定，分别切出2690bp和105bp大小的片段结果与预期结果一致（图1）。测序结果表明重组质粒中含有PRRSV ORF7基因的部分核苷酸序列。

图1 PRRSV ORF7基因PCR及双酶切鉴定图1，2：PRRSV ORF7基因 PCR 产物；3：pMD-ORF7双酶切产物；M：DL2000MarkerFig.1 PRRSV ORF7gene PCR and double enzymatic digestion identification1，2：PRRSV ORF7gene PCR product；3：pMDORF7double enzymatic digestion product；M：DL2000Marker

3.2 重组质粒浓度的测定 提取的质粒DNA经核酸蛋白仪测定，其质粒浓度为0.404mg/mL，OD260nm/OD280nm比值为1.83，符合纯度要求。经计算该阳性重组质粒的拷贝数为3.51×l012个拷贝/μL。

3.3 探针浓度的优化 引物浓度以宝生物Premix Ex TaqTM中推荐的0.2μmol/L为最佳引物浓度，并以相同浓度的核酸为模板的反应体系中，先用不同浓度范围的探针，进行荧光定量PCR。以循环Ct值最小，荧光强度增加值（ΔRn）最大为选定原则。经优选后探针的最佳浓度分别为0.4μmol/L。

3.4 标准曲线的建立 按上述优化的反应条件，取109、108、107、106、105、104拷贝/μL的重组质粒作为标准阳性模板，分别进行扩增，系统自动分析软件显示Ct值与标准阳性模板浓度的对数之间存在良好的线性关系，相关系数（R2）为0.998，PCR扩增效率为97.9%（图2）。

图2 浓度为109-104拷贝/μL的PRRSV质粒标准品的FQPCR扩增标准曲线Fig.2 Concentration 109-104 copies/μL PRRSV plasmids standard amplification plot of real-time FQ-PCR for PRRSV

3.5 荧光定量PCR的敏感性试验 对PRRSV阳性标准质粒进行10倍稀释后用荧光定量PCR方法进行检测，结果表明质粒浓度为3.51拷贝/μL时，仍能出现典型的扩增曲线，显示出良好的敏感性。

3.6 荧光定量PCR的特异性试验 PRRSV 3.51×108、3.51×107、3.51×106、3.51×105、3.51×104拷贝/μL 的阳性质粒以及 PCV-2、CSFV、HCV、PRV、PPV的病毒核酸为模板，用建立的TaqMan荧光定量PCR系统进行检测。结果表明除PRRSV模板检测有扩增曲线外，其余的均为阴性，无任何交叉反应，呈现出良好的特异性。

3.7 荧光定量PCR的重复性试验 以3.51×109、3.51×108、3.51×107拷贝/μL浓度的质粒标准品作3次重复检测，结果不同核酸浓度各自的检测Ct值变异系数分别为0.78%、0.71%、0.78%，表明检测方法具有较好的稳定性（表1）。

表1 FQ-PCR的重复性试验Tab.1 Repeatability test of real-time FQ-PCR for PRRSV

3.8 临床样品的检测 30份临床样品中用本研究中建立的FQ-PCR方法检测出28份样品为阳性，而用常规PCR方法检测仅有25份为阳性。对常规PCR检测为阳性的样品进行荧光定量PCR检测也为阳性。对常规PCR检测为阴性的5份样品进行荧光定量PCR检测，有3份样品为阳性。病毒分离的结果则与FQ-PCR法检测得到的结果完全一致，说明，建立的方法可以很好的用于临床样品的诊断。

4 讨 论

PRRSV ORF7编码核衣壳蛋白，即N蛋白，它是PRRSV最小的结构蛋白，相对的保守，也是免疫原性最强的蛋白，在病毒粒子中含量较高，约占病毒蛋白总量的20%～40%［9］。N蛋白包括对所有毒株保守的共同表位，又有对美、欧洲型分离株特异的表位。国外，有许多研究者制备了多株N蛋白的单克隆抗体对其抗原表位进行研究，结果表明欧洲分离株和美洲分离株的N蛋白具有高度保守的抗原表位［10－12］。由于猪感染PRRSV后，动物机体首先产生的是针对N蛋白的抗体，并且抗体在体内的存留时间较长，可以根据N蛋白抗体的水平的高低，对机体的发病情况和免疫水平做出合理的评价，因此，N蛋白可作为PRRSV抗体检测的诊断抗原［13］。本研究选用相对保守的N蛋白，建立了检测PRRSV的TaqMan实时荧光定量PCR方法。试验结果显示，所建立的检测方法能特异、灵敏地对PRRSV进行快速检测，为PRRSV的快速诊断方法的研究奠定了基础。

试验证实该方法特异性强，不与其他任何病原发生假阳性反应；灵敏度高，检测灵敏度可达3.51拷贝/μL。用该方法初步用于临床疑似病料的检测中，并与常规RT-PCR方法进行比较，结果显示：与常规RT-PCR相比较，本试验所建立的方法不但可以定性检测PRRSV，还可以定量检测PRRSV，而且能够检测出常规RT-PCR无法检测的病料，同时也免去了DNA水平电泳的步骤，更加省时，且操作简单。因此，该方法具有快速、灵敏、特异、定性、定量等优点。

国内将荧光定量PCR应用于PRRSV的检测已有报道。杨宗照等［14］建立了实时荧光定量PCR技术检测高致病性PRRSV，该方法能快速、简便地检测到HP-PRRSV的存在。杨春华等［15］等建立了检测PRRSV的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法，该方法检测灵敏度可达10拷贝/μL，并具有良好的特异性和重复性。但这些建立的方法均采用了SYBR Green染料法，该方法虽然在操作中更加简便，但荧光染料能和任何dsDNA结合，因此它也能与非特异的dsDNA（如引物二聚体）结合，使实验容易产生假阳性信号，从而造成特异性低。而本研究中运用了TaqMan技术建立了检测PRRSV的实时荧光PCR，一方面提高了检测的灵敏度和准确性，另一方面又提高了检测的特异性。

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