抗人红细胞单链抗体与狂犬病毒G蛋白双功能融合蛋白的构建及生物学活性检测＊

周松峰，廖文军，覃绍敏，袁书智，白安斌，吴健敏

狂犬病是由狂犬病病毒（rabies virus，RV）引起的中枢神经系统感染的急性人畜共患传染病。所有温血动物都可感染，狂犬病一旦发病，病死率几乎100%［1］，是人类病死率最高的急性传染病之一。狂犬病病毒G基因编码的糖蛋白（glycoprotein，GP）是病毒唯一暴露在表面的蛋白［2］，是唯一能刺激机体产生中和抗体的病毒蛋白［3］，在狂犬病毒致病和免疫中起着关键作用［4］。

狂犬病的诊断方法目前主要有中和试验、免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）、反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）等，但这些检测方法对仪器和专业人员的依赖性较高，检测成本昂贵，且耗时相对较长，极大的限制了它们在基层单位的应用，由于我国面积辽阔，农村散养犬较多，在开展RV的监测及免疫效果评估时，急需建立一种快速、敏感、稳定，可以现场使用的检测方法。

近年来自体红细胞凝集试验发展迅速［5］，已在多个检测领域得到应用［6－7］。该方法的基本原理是：以红细胞作为指示细胞，利用基因工程方法构建一种重组双功能融合蛋白（目标抗原或抗体与红细胞非凝集型抗体［8］联结而形成的抗原－抗体或抗体-抗体结合物），该融合蛋白既能与红细胞结合又能与被检抗体/抗原结合，通过样品中被检抗体/抗原的桥联作用，使指示红细胞发生凝集，根据指示红细胞的凝集现象达到快速检测的目的。

本实验室利用该技术成功建立了检测猪瘟、猪伪狂犬病毒的红细胞凝集试验［9－10］。因此本试验拟在此基础上利用（SOE）PCR技术，将狂犬病毒G基因主要抗原表位区kg与抗人红细胞H抗原单链抗体2E8scFv［11］拼接成双功能融合基因，进行表达复性并对表达蛋白进行检验，构建既能与人红细胞结合，又能与RV抗体反应的双功能融合蛋白。目的是为了进一步建立狂犬病毒抗体快速检测红细胞凝集试验方法。

1 材料与方法

1.1 重组质粒、载体、菌株和血清 重组质粒pMD-G（含有狂犬病毒G基因主要抗原表位区）、鼠抗RV高免血清由军事医学科学院军事兽医研究所扈荣良研究员惠赠；重组质粒pMD-2E8scFv（含有抗人红细胞H抗原单链抗体基因）［11］由军事医学科学院野战输血研究所章金刚研究员惠赠；原核表达载体pET-TrX、表达菌株BL21（DE3）pLysS均由本实验室保存；7份RV阳性血清、7份RV阴性血清、犬细小病毒（CPV）阳性血清、犬瘟热病毒（CDV）阳性血清均由本实验室保存。

1.2 主要试剂 Kod-plus高保真酶为TOYOBO（日本）产品；T4DNA连接酶、限制性内切酶BamHI、EcoRI、及TaqDNA 聚合酶均购自 TaKaRa（日本）公司；IPTG购自Promega公司产品；BCA蛋白定量试剂盒购自TIANGEN公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗鼠IgG为Beyotime产品；Ni-NTA蛋白纯化树脂为QIAGEN公司产品；氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽均为Sigma公司产品；其它化学试剂均为南宁（中国）生化药品仪器公司分析纯产品。

1.3 重组PCR引物设计 根据重叠延伸PCR的原理和狂犬病毒G基因与2E8scFv基因序列，设计4条重组PCR引物 （表1）。其中引物2E8scFv-U/2E8scFv-D用于扩增合成2E8scFv基因，引物Kg－U/Kg-D用于扩增合成Kg基因。2E8scFv3′末端15个碱基和Kg5′端15个碱基为互补序列（阴影部分）用于基因的拼接，拼接顺序为2E8-Kg。2E8scFv-U 和 Kg-D中的下划线部分为引入的BamH I、EcoR I酶切位点。

表1 2E8scFv、Kg基因引物序列Tab.1 Primers of 2E8scFv and Kg

1.4 2E8Kg融合基因原核表达载体的构建及鉴定 以2E8scFV-U/2E8scFV-D和 Kg-U/Kg-D为引物，从pMD-2E8scFv和pMD-G重组质粒中分别扩增融合基因2E8Kg的5′端片段2E8scFv和3′端片段Kg基因。PCR扩增条件均为：95℃预变性5 min；95℃变性1min，60℃退火30s，72℃延伸70 s，30个循环；72℃延伸10min。以纯化后的2E8scFv和Kg基因为模板，采用（SOE）PCR方法拼接成2E8Kg融合基因。第一轮PCR反应体系为：2E8scFv和 Kg基因各0.5μL、10× Buffer2.5 μL、5U/μL KOD-plus高保真酶0.5μL，10mmol/L dNTPs 2.5μL、用灭菌双蒸水加至总体积25μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性1 min，60℃退火1min，72℃延伸2min，7个循环。当第一步反应结束后，在反应体系中加入引物2E8scFv-U和 Kg-D各0.5μL，然后95℃预变性5 min；95℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸10min。将上述PCR产物纯化回收后与pMD18-T Simple载体连接，转化DH5α感受态细胞，提取质粒，经PCR及BamH I、EcoR I双酶切鉴定后送测序公司测序。测序正确后将融合基因2E8kg亚克隆到原核表达载体pET-Trx中，构建了原核表达质粒pETTrx-2E8kg。

1.5 2E8Kg融合基因的诱导表达及SDS-PAGE分析 将鉴定正确的pET-Trx-2E8Kg原核表达质粒转化入BL21（DE3）pLysS中进行诱导表达，表达后经SDS-PAGE电泳验证其是否表达，用Band-Scan软件测定目的蛋白相对含量。离心收集诱导表达菌液，用细菌洗涤液初步洗涤后，加入细裂解液作用30min后用细胞破碎仪菌破碎处理3遍，分别收集沉淀和上清，沉淀用包涵体洗涤液洗涤两遍后，用包涵体溶解液溶解，将上述溶解液和上清样品进行SDS-PAGE电泳，进行可溶性分析。

1.6 2E8Kg融合蛋白的纯化与复性 将诱导菌液扩大培养，按上述方法制备包涵体后，采用亲和层析法和谷胱甘肽再氧化法对融合蛋白进行纯化和复性，复性24h后，用透析液透析48h，每6h换液一次，透析袋内的液体即为纯化和复性后的蛋白。用PEG20000浓缩复性蛋白，并用BCA蛋白定量试剂盒测定其浓度。

1.7 2E8kg融合蛋白的 Western-blot检测 将纯化后的2E8kg融合蛋白经SDS-PAGE电泳后，转移至硝酸纤维素膜（NC）上，将膜用封闭液（5%的脱脂奶粉）4℃封闭过夜，用TBST洗涤，一抗加入鼠抗RV高免血清，二抗为辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗鼠IgG，最后用二氨基联苯胺（DAB）底物显色液显色，边摇动边观察，至条带清晰后加入双蒸水终止其反应，观察结果。

1.8 红细胞凝集试验检测2E8kg融合蛋白的双功能生物学活性 取7份RV阳性血清，同时设7份RV阴性血清作对照，取96孔血凝板，每孔中加入50μL，然后再向每个孔中依次加入10μL双功能融合蛋白（1.2mg/mL）和20μL 2%O型人红细胞，混匀后静置30min观察结果；分别取A、B、AB型人红细胞，按同样的方法操作，观察结果。

2 结 果

2.1 2E8Kg融合基因原核表达载体的构建 以重组质粒pMD-2E8scFv和pMD-G为模板，分别扩增出两条大小分别为732bp和999bp的目的片段，命名为2E8scFv和Kg（如图1），与预期扩增片段一致。以琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段2E8scFv和Kg为模板，通过（SOE）PCR拼接成2E8Kg融合基因，将其克隆到pMD18-T Simple载体上，鉴定正确后插入原核表达载体pET-Trx，通过PCR（如图2）及BamH I、EcoR I双酶切鉴定后测序，测序结果表明该片段与融合基因2E8Kg一致，大小为1 731bp且读码框正确。表明融合基因和原核表达载体构建成功。

图1 目的基因2E8scFv和Kg的PCR扩增图M：DNA2000标准分子量；1：Kg基因；2：2E8scFv基因Fig.1 PCR amplification of 2E8scFv and Kg genesM：DNA Marker 2000；1：Kg gene；2：2E8scFv gene

图2 融合基因2E8Kg的SOE-PCR扩增图M.DNA2000标准分子量；1.2E8Kg融合基因Fig.2 Amplification of 2E8Kg fusion gene by SOE-PCRM：DNA Marker 2000；1：2E8Kg fusion gene

2.2 2E8Kg融合蛋白的表达、可溶性分析、复性及纯化 取pET-Trx-2E8Kg阳性转化菌进行IPTG诱导表达，同时设pET-Trx空载体转化菌为对照，结果在37℃，IPTG 浓度为0.7mmol/L，诱导3h时获得最大表达，表达量占菌体蛋白总量23.5%左右。SDS-PAGE分析表明，表达产物主要以不溶的包涵体形式存在，相对分子质量约77.7kD（如图3），与预期蛋白分子大小一致。利用亲和层析法对变性溶解的目的蛋白进行纯化并用BandScan生物学软件进行分析，结果表明目的蛋白洗脱后的纯度提高到了98.9%（图略）。BCA蛋白定量试剂盒测定复性浓缩后蛋白含量约为1.7mg/mL。

图3 pET-Trx-2E8Kg重组菌表达产物的SDS-PAGE电泳的结果M.低分子量蛋白marker；1.空载体对照；2.诱导后重组菌蛋白Fig.3 Identification on expressed product of pET-Trx-2E8Kg recombinant bacteria by SDS-PAGEM：Protein MW marker；1：Negative control；2：Recombinant bacteria protein after induction

2.3 2E8Kg融合蛋白 Western-blot检测 用RV高免血清对2E8Kg融合蛋白进行 Western-blot检测，结果发现约在77.7kDa处出现一条特异性条带，而同时用CPV和CDV阳性血清对2E8Kg融合蛋白进行Western-blot检测，结果无任何免疫印迹条带出现（图4），说明2E8kg融合蛋白能够与RV高免血清发生特异反应，具有良好的免疫反应原性。

2.4 红细胞凝集试验检测2E8Kg融合蛋白的生物学活性 用纯化和复性后的2E8Kg融合蛋白、2%人“O”型红细胞、7份RV阴、阳性血清进行红细胞凝集试验，结果7份RV阳性血清均可观察到强凝集现象（图5），而7份RV阴性血清未观察到凝集现象（图6）。用血型定型试剂盒筛选出A、B和AB型人红细胞与RV阳性血清进行同样的试验，结果也观察到强凝集现象（图7）。用CPV，CDV阳性血清分别与2E8Kg融合蛋白作用，结果未发生凝集（图8）。上述结果说明2E8Kg融合蛋白不但能够与RV高免血清发生特异反应，而且能与人红细胞结合（无血型限制），具有双功能特性。

图4 pET-Trx-2E8Kg重组菌表达产物的 Western-blot鉴定M.低分子量蛋白 marker；a.空载体对照；b.诱导后pET-Trx-2E8Kg重组菌蛋白；c.CPV阳性血清阴性对照；d.CDV阳性血清阴性对照。Fig.4 Identification on expressed product of pET-Trx-2E8Kg recombinant bacteria by Western-blotM：Protein MW marker；a：Negative control；b：Recombinant bacteria pET-Trx-2E8Kg protein after induction；c：Negative control of CPV positive serum；d：Negative control of CDV positive serum

图5 狂犬病毒阳性血清与2E8Kg双功能融合蛋白及人O型红细胞的红细胞凝集试验Fig.5 Erythrocyte agglutination test of 2E8Kg fusion pro－tein，RV positive serum，and O type human red blood cells；

图6 狂犬病毒阴性血清与2E8Kg双功能融合蛋白及人O型红细胞的红细胞凝集试验Fig.6 Erythrocyte agglutination test of 2E8Kg fusion pro－tein，RV negative serum，and O type human red blood cells；

图7 狂犬病毒阳性血清与2E8Kg双功能融合蛋白及人红细胞的红细胞凝集试验Fig.7 Erythrocyte agglutination test of 2E8Kg fusion pro－tein，RV positive serum，and human red blood cells；

图8 犬不同病毒阳性血清与2E8Kg双功能融合蛋白及人O型红细胞的红细胞凝集试验Fig.8 Erythrocyte agglutination test of 2E8Kg fusion pro－tein，different virus－positive serum of dog，and O type human red blood cells.

3 讨 论

狂犬病是人畜共患的自然疫源性传染病，目前尚无有效的治疗方法，疫苗免疫预防狂犬病的发生尤其重要［12］。我国狂犬病发病死亡人数位居重点传染病死亡数和病死率榜首，易感动物发病呈逐年上升的趋势，要彻底根除狂犬病，首先就必须消灭动物的狂犬病，特别是隐性带毒动物及野生动物的狂犬病。针对狂犬病的现状，如何利用有效的诊断方法对隐性带毒动物快速诊断，对狂犬病疫苗免疫后的动物进行抗体监测及免疫效果评估，是保证人和动物安全的当务之急。

目前，狂犬病现有的诊断方法对仪器和专业人员的要求较高，检测成本昂贵，且耗时相对较长，因而极大的限制了它们在基层单位的使用。从而导致动物狂犬病免疫效果评估的工作开展较为困难，这对控制和消灭动物狂犬病十分不利。自体红细胞凝集试验以其快速、简便、不需要任何仪器，仅凭肉眼就可以观察结果的特点在人类疾病快速诊断中得到了较好的应用。由于犬红细胞表面抗原十分复杂，要寻找到各类血型的共有抗原十分困难，为此，本研究借助表面抗原背景清楚的人红细胞作为指示剂建立检测动物病原抗体的红细胞凝集实验方法。

由于本实验拼接的融合基因长度较长，在初步PCR扩增和拼接的过程中，发生了基因突变，1 237位碱基由A突变为T，形成了一个终止密码子TGA，无法正确表达此融合蛋白。为此改用Kodplus高保真酶对其进行扩增，扩增结果测序没有发生碱基的突变。构建原核表达体系一般需要综合考虑3大因素：表达载体、宿主菌株、表达诱导条件。本试验在融合蛋白表达的过程中尝试了多种可溶性原核表达载体，都没有得到相应的可溶性表达或表达量太低。在经过表达诱导条件的筛选、优化后，最后选取原核表达载体pET-Trx，在37℃，IPTG浓度为0.7mmol/L，诱导3h时获得较高的表达。由于表达产物以不溶的包涵体形式存在，该融合蛋白需要经过复杂的包涵体溶解、变性、复性过程，这极大的影响了融合蛋白的生物学活性，导致在目前建立的红细胞凝集试验过程中出现凝集的时间较长，与人血型检测的速度相比仍有一定的差距，估计与2E8kKg双功能融合蛋白生物学活性不高有关。为此本试验拟从以下3个方面进行研究，一是筛选不同的宿主菌株；二是在2E8scFv与RV-Kg基因两个功能区之间引入一个连接肽，以克服因直接拼接，造成两个功能区相互遮掩而导致活性下降的可能。三是继续寻找新的可溶性表达系统及可溶性表达条件，达到获得双功能融合蛋白的可溶性表达，减少因包涵体变性、复性造成活性降低的目的。

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