白藜芦醇的体外抗氧化活性

张泽生，贺 伟，刘甜甜，史 珅,2，李 森

(1.食品营养与安全省部共建教育部重点实验室，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457；2.天狮集团有限公司博士后工作站，天津 301700)

白藜芦醇的体外抗氧化活性

张泽生1，贺 伟1，刘甜甜1，史 珅1,2，李 森1

(1.食品营养与安全省部共建教育部重点实验室，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457；2.天狮集团有限公司博士后工作站，天津 301700)

通过对DPPH自由基、ABTS＋·的清除能力和还原力的测定，探讨白藜芦醇的抗氧化活性；并采用过氧化氢诱导红细胞自氧化模型和肝组织脂质过氧化反应模型，探讨白藜芦醇对自由基损伤和脂质过氧化反应的抑制作用。结果显示，白藜芦醇具有很强的清除自由基和抑制自由基引起的氧化损伤的能力。

白藜芦醇；抗氧化；DP P H自由基；ABTS＋·；还原力；脂质过氧化

白藜芦醇是蒽醌萜类化合物，主要存在于葡萄、藜芦、虎杖等植物中，结构与合成的雌激素类化合物己烯雌酚类似，被认为是一种植物雌激素[1]。近年，白藜芦醇因其具有的诸如抗肿瘤[2-6]、抗辐射[7]、保护心血管[8-10]、保肝护肝[11-12]等广泛的生物学活性，而备受研究者关注。采用DPPH自由基、ABTS＋·的清除能力及还原力的测定实验，研究白藜芦醇对自由基的清除能力，并分别选用红细胞氧化和肝组织体外氧化模型，探讨其对氧化损伤的抑制作用，旨在为白藜芦醇作为抗氧化保健食品的深入研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料、动物与试剂

白藜芦醇由天津尖峰天然产物研究开发有限公司提供；小鼠，IC R，SPF级，雄性，1 8～2 2 g。

ABTS、DPPH 美国Sigma公司；其他试剂为分析纯。

1.2 仪器与设备

J-E冷冻离心机 美国Beckman公司；AB204-N分析天平 日本岛津公司；SP-2102UV分光光度计 上海光谱仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 白藜芦醇清除DPPH自由基能力的测定

DPPH用于抗氧化物质的研究方法由Blois等[13]首次提出，本研究中，白藜芦醇对DPPH自由基的清除能力的测定在此基础上参照Brand-William等[14-15]的方法，结合Yamagnchi等[16]的研究方法进行改良。选取VC与BHT作为对照样品以乙醇为溶剂，分别配制不同质量浓度的样品溶液，取0.1mL样液同1.0mL DPPH乙醇溶液混匀，乙醇溶液为空白样液，于37℃反应60min后在波长517nm比色，DPPH自由基清除率采用公式(1)计算。

式中：A样品为517nm波长处不同质量浓度样品的吸光度；A空白为517nm波长处空白管的吸光度。

1.3.2 白藜芦醇清除ABTS＋·能力的测定

采用Trolox等价抗氧化能力法对白藜芦醇清除ABTS＋·的能力进行测定，参照Miller等[17]和Rice-Evans 等[18]的研究方法，先配制浓度为2.45mmol/L的ABTS＋·储备液，临用时用无水乙醇稀释得到ABTS＋·工作液(30℃，734nm波长处吸光度为0.70±0.02)。以VC和BHT作为阳性对照，按照公式(2)计算ABTS＋·的清除率。

1.3.3 白藜芦醇还原力的测定

取样品1mL溶于水配成25～100μg/mL，加pH6.6、2.5mL 0.2mol/L磷酸盐缓冲液和2.5mL 1g/100mL K3Fe(CN)6溶液混匀后50℃水浴20min，迅速冷却，然后加入2.5mL10g/100mL三氯乙酸，5000r/min离心10min，取上清2.5mL 加2.5mL蒸馏水和0.5mL 0.1g/100mL三氯化铁，混合后在700nm测定吸光度。实验采用BHT和VC作为对照品。

1.3.4 白藜芦醇对H2O2引起的小鼠红细胞氧化溶血的影响

取健康小鼠，眼底静脉丛取血，1mg/mL肝素钠抗凝，0.9g/100mL NaC1溶液洗涤3次，制成0.5%的红细胞悬液。取该红细胞悬液1mL，加入到各试管，根据后面加入试剂的不同可分为空白管、对照管、测试管：测试管是分别加入不同质量浓度样品0.2mL，对照管和空白管则加0.2mL生理盐水，摇匀。对照管和测试管加100nmol/mL H2O20.2mL启动反应，同时对照管补充0.2mL蒸馏水。37℃水浴1h，取出用生理盐水稀释6倍，2500r/min离心10min，取上清于415nm波长处测定吸光度。按照式(3)计算红细胞溶血抑制率。

式中：A0为对照组吸光度；A1为加样品组吸光度；A为H2O2诱导组吸光度。

1.3.5 白藜芦醇对小鼠肝组织脂质过氧化作用的影响

取正常小鼠禁食过夜，次日处死，迅速取出肝脏，置4℃生理盐水中反复漂洗，剔除脂肪及结缔组织，用滤纸吸干水分，称质量，然后剪碎，匀浆，后在冰浴条件下用生理盐水制成10%的组织匀浆，所得匀浆5000r/min离心10min，取上清液备用。

分别取1mL 5% 的新鲜肝组织匀浆液，加入1mL不同质量浓度的样品溶液，每个质量浓度的样品管均为待测管，对照管加1mL生理盐水，置于37℃水浴1h，取出后加入1mL的15g/100mL的三氯乙酸终止反应，再加0.67g/100mL TBA 1mL，混匀后置于沸水浴中加热15min，流水冷却，以3000r/min离心10min，除去蛋白质沉淀后，取上清液与532 nm波长处测定丙二醛MDA-TBA复合物的吸光度，BHT作阳性对照，待测样品的抗氧化活性以抑制率表示。

式中：A为对照管吸光度；A1为待测管吸光度。

2 结果与分析

2.1 白藜芦醇清除DPPH自由基的能力

图1 白藜芦醇清除DPPH自由基的能力Fig.1 DPPH radical scavenging capacity of resveratrol

由图1可知，白藜芦醇在62.5～1000μg/mL范围内呈现随质量浓度的递增，清除率也呈逐渐增强的趋势，质量浓度达到1000μg/mL时，清除率超过82%；在62.5μg/mL时，其清除率超过对照样VC及BHT，在125μg/mL时，其清除DPPH自由基能力仍略强于BHT。

2.2 白藜芦醇清除ABTS＋·的能力

图2 白藜芦醇清除ABTS＋·的能力Fig.2 ABTS radical scavenging capacity of resveratrol

由图2可知，白藜芦醇在2～250μg/mL范围内呈现随质量浓度递增，清除自由基能力增强的趋势，在2～62.5μg/mL范围内增强趋势最强，质量浓度进一步增大时趋势变缓，当样品质量浓度达250μg/mL时，清除率超过92%；在低于25.6μg/mL时，其清除率超过对照样VC及BHT，在31.5μg/mL时，其清除DPPH自由基能力仍强于BHT。

2.3 白藜芦醇的还原力

由图3可知，白藜芦醇在质量浓度3～200μg/mL范围内呈现随质量浓度递增，还原力呈现逐渐增强的趋势；在质量浓度低于25μg/mL时，其还原力超过对照样VC。

图3 白藜芦醇的还原力Fig.3 Reducing power of resveratrol

有研究者[19]认为白藜芦醇具有很强的清除自由基的能力，本研究通过体外化学实验发现，白藜芦醇的在体外抗氧化能力很强，并且在较低质量浓度时其清除自由基的能力较VC等强氧化剂更强。

2.4 白藜芦醇对过氧化氢引起的小鼠红细胞氧化溶血的影响血红细胞是机体一类重要的功能性细胞，大量存在于人和动物的外周血中，主要承担机体运输气体，尤其是氧气的责任。Nagababu等[20]发现血红细胞在过氧化氢诱导或自发进行的膜氧化过程会导致铁元素的积累，引起细胞膜的损伤，进而缩短红细胞寿命。实验通过过氧化氢诱导红细胞的系列氧化损伤模型，研究白藜芦醇对红细胞的保护作用。

表1 白藜芦醇对过氧化氢引起的红细胞氧化溶血的抑制率Table 1 Inhibitory rate of resveratrol on erythrocyte oxidation induced by H2O2%

由表1可知，在实验研究的质量浓度0.13～0.50mg/mL范围内，白藜芦醇对过氧化氢引起的小鼠血红细胞氧化损伤产生的溶血现象具有抑制作用，在质量浓度0.13mg/mL时，其抑制作用较VC更强。

2.5 白藜芦醇对小鼠肝组织脂质过氧化作用的影响

由表2可知，在质量浓度0.10～1.00mg/mL范围内，白藜芦醇对肝组织脂质过氧化反应具有抑制作用，在质量浓度为0.10mg/mL和0.50mg/mL时，其抑制作用较VC更强。

3 结 论

白藜芦醇作为一种天然活性物质，在体外具有很强的还原力，并且可以有效的清除DPPH自由基、ABTS＋·；同时在细胞和组织水平，对于自由基参与的红细胞溶血和肝组织过氧化的相关反应，有显著抑制和延缓作用。可见，白藜芦醇在体外具有很强的抗氧化活性，对其进行深入的动物模型研究和作用机制探讨，将对目前备受关注的抗衰老研究，具有深刻意义。后期，本课题组将对白藜芦醇进行进一步的动物模型研究和作用机制的分子水平探讨，以期为深入开发和应用这一资源提供更丰富的科学实验依据。

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Antioxidant Activity of Resveratrol in vitro

ZHANG Ze-sheng1，HE Wei1，LIU Tian-tian1，SHI Shen1,2，LI Sen1
(1. Key Laboratory of Food Nutrition and Safety, Ministry of Education, College of Food Engineering and Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China；2. Tiens Group Co. Ltd., Post-doctoral Workstation, Tianjin 301700, China)

In the present study, the antioxidant activity of resveratrol in vitro was evaluated based on DPPH radical scavenging capacity, ABTS free radical scavenging capacity and reducing power, respectively. Meanwhile, the oxidation model of red blood cells induced by hydrogen peroxide and liver lipid peroxidation model were used to explore the inhibitory effect of resveratrol on free radical-induced damages and lipid peroxidation. The results showed that resveratrol had strong scavenging activity against free radicals and inhibitory effect on oxidative damage induced free radicals in a dose-dependent manner.

resveratrol；antioxidation；DPPH free radical；ABTS free radical；reducing power；lipid peroxidation

TS201.2

A

1002-6630(2012)11-0266-03

2011-06-02

高等学校博士学科点专项科研基金项目(20101208110001)

张泽生(1956—)，男，教授，博士，主要从事营养与功能性食品、天然产物研究。E-mail：zhangzesheng@tust.edu.cn