茶树油、丁香酚和柠檬醛对荔枝黑曲霉的抑制作用

钟业俊，徐欣源，刘成梅,*，孙 健，吴建永，刘桃英

(1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.广西农业科学院农产品加工研究所，广西 南宁 530007)

茶树油、丁香酚和柠檬醛对荔枝黑曲霉的抑制作用

钟业俊1，徐欣源1，刘成梅1,*，孙 健2，吴建永1，刘桃英1

(1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.广西农业科学院农产品加工研究所，广西 南宁 530007)

研究茶树油、丁香酚和柠檬醛的挥发性香氛对荔枝致腐真菌黑曲霉的抑制作用，采用复配方法探究3种香料对黑曲霉的协同抑菌性。结果表明：丁香酚和柠檬醛的挥发性香氛对黑曲霉有较强的抑制作用，最低抑菌浓度分别为0.3μL/cm3和0.4μL/cm3；茶树油挥发性香氛抑制黑曲霉的作用稍差，但与丁香酚和柠檬醛复配后协同抑菌作用增强。

茶树油；丁香酚；柠檬醛；黑曲霉；抑菌作用

由于荔枝果实特殊的形态生理结构，以及在盛夏高温季节成熟等原因，采后真菌的繁殖生长是导致荔枝在存贮运输期间腐烂变质的重要原因，而一般化学保鲜剂由于具有不安全因素[1]，已经造成人们的恐惧和抵触，作为替代的天然保鲜剂则受到越来越多的关注。

香辛料来源于植物的种子、花蕾、叶茎、根块等，具有特殊的生理药理作用，其中一部分还有抗菌防腐作用。Thyagaraja等[2]研究发现香辛料的乙醇提取物对致腐真菌如曲霉、根霉、毛霉有较强的抑制效果。Weerakkody等[3]研究高良姜、藤黄、山胡椒等的体外抑菌实验时发现香料的抑菌效果与其在溶剂中的溶解性呈正相关。Cerrutti等[4]发现香草醛对苹果皮表面致腐酵母菌的生长有抑制作用，并有助于延长苹果的保质期。Nielsen等[5]发现香料精油对面包致霉微生物具有很明显的抑制作用。此外，朱玉生[6]、吴克刚[7]等利用香辛料与致腐真菌直接接触，取得了较好的抑菌效果。张宽朝等[8]研究发现，直接用香料挥发出来的香氛进行抑菌简便易行，可以避免由于香料疏水性导致的涂膜分布不均、抑菌效果下降的现象，且香氛抑菌并不直接接触果蔬表面，安全可靠。

本实验以茶树油、丁香酚和柠檬醛为抑菌剂，研究其挥发性香氛对导致荔枝腐烂的黑曲霉的抑菌效果，以及3种抑菌剂的协同增效作用，以期为挥发性香料用于荔枝保鲜提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

荔枝黑曲霉(Aspergillus niger)由南昌大学中德食品工程中心自腐烂荔枝果实上挑取少量病原菌孢子[9]经连续稀释法分离筛选[10]得来。使用的培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)以及查氏酵母膏琼脂培养基(CYA)[10]。通过对该菌株菌落及菌体的形态学观察，根据《中国真菌志 曲霉属及其相关有性型》[11]以及《Identification of Common Aspergillus Species》[12]对分离出来的病原菌进行分类鉴定，符合黑曲霉特征。

丁香酚(纯度≥95%，批号110725-200610)、柠檬醛(纯度≥95%，为其异构体牻牛儿醛(geranial)和橙花醛(nersal)的混合物，相对密度0.893(25℃)，沸点228～229℃，批号113898-200912) 上海恒远生物科技有限公司。

茶树油(Melaleuca alternifolia)，无色液体，采用湛江市麻章区种植的白千层树，2010年10月经中国热带农业科学院农产品加工研究所提取获得，各项指标均达到国际标准ISO4730-1996《白千层萜品醇油(茶树油)》要求。检出主要技术指标：异松油烯3.83%、1.8-桉叶素4.63%、α-松油烯10.42%、γ-松油烯20.26%、对伞花烃2.34%、松油烯醇-4 35.62%、α-松油醇2.97%、葶烯1.64%、桧烯0.36%、香树烯1.02%、δ-杜松烯0.64%、蓝桉醇0.58%、绿花白千层醇0.25%、α-蒎烯2.86%；20℃时折光指数1.48，相对密度0.890，旋光度7.45°。

1.2 方法

1.2.1 培养基的制备

采用马铃薯葡萄糖培养基(PDA培养基)[8]。称取去皮洗净后的新鲜土豆200g，加水800mL煮沸至土豆煮透煮烂，此过程大约20～30min。4层纱布过滤，取滤液。向滤液中加入300mL蒸馏水、20g葡萄糖，搅拌均匀后继续加热煮沸。称取20g琼脂，用剪刀剪成小块后加入沸腾的滤液中，同时不断用玻璃棒进行搅拌，促进琼脂溶解均匀并防止结底。待全部溶解后分装入锥形瓶中，灭菌备用。

1.2.2 霉菌菌饼的制备

选用直径为9cm的无菌培养皿，倒入经高温灭菌的PDA培养基，制成平板。待冷凝后用黑曲霉孢子的生理盐水悬浮液进行涂布。30℃培养72h，使菌丝均匀生长。用直径为5mm的打孔器在上述长满菌丝的培养基上打孔，切下带菌培养基制取菌饼备用[13]。

1.2.3 菌饼的移植

准备直径9cm的洁净无菌培养皿，倒入等量无菌PDA培养基，立即将制备好的菌饼用挑针挑取后菌丝面向上放置在培养皿的中央，待培养基完全冷凝后，将培养皿倒置于无菌操作台上。

1.2.4 单一香料挥发气氛对黑曲霉的抑制实验

倒有PDA培养基的培养皿内部体积基本一致，约为30cm3。由此进行实验设计，考察茶树油、柠檬醛和丁香酚浓度对黑曲霉抑制的影响，分为3个实验组：1)分别加入3、6、12、18μL茶树油，即茶树油的浓度对应为0.1、0.2、0.4、0.6μL/cm3(以空气体积计算，下同)。2)分别加入3、6、9、12μL柠檬醛，对应浓度为0.1、0.2、0.3、0.4μL/cm3。3)分别加入3、6、9、12μL丁香酚，对应浓度为0.1、0.2、0.3、0.4μL/cm3。

1.2.5 抑菌率的测定

采用菌丝生长速率抑菌率法[9]作为抑菌效果的评价指标。将香料溶液均匀添加到无菌棉纸(5.5mm×6.5mm)上，迅速贴于移植了菌饼的培养皿盖上，不接触培养基，置于30℃恒温培养箱中培养，每天按照十字交叉法测量菌饼直径，计算生长量和抑菌率[9]，实验重复3次，取平均值。对照组不添加任何香料，其他操作一致。

1.2.6 单一香料挥发气氛的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度

实验进行到第5天时，观察含有香料香氛的培养皿，以菌丝纯生长量为0的培养皿中含有的香料最低浓度作为该香料挥发气氛的最低抑菌浓度(CMIC)。挑取上述菌丝纯生长量为0的培养皿中的黑曲霉孢子接种到空白PDA培养基中继续培养5d后，以完全没有菌生长的最低浓度作为该香料挥发气氛的最低杀菌浓度(CMBC)。

1.2.7 香料挥发性香氛的协同抑菌实验

采用L9(33)正交试验设计，研究茶树油、丁香酚和柠檬醛的香料配比对挥发性香氛抑菌性的影响。香料液的复配比例按因素水平表进行，混合后用涡旋振荡器进行充分混匀，分别取6μL 混合香料液(即0.2μL/cm3)添加到PDA培养皿中，添加方法同1.2.5节。

1.2.8 数据分析和处理

采用方差分析(ANOVA)在5%置信度下比较香料配比对抑菌效果的影响，实验重复3次，结果用“χ-±s”表示。

2 结果与分析

2.1 不同香料的挥发性香氛对荔枝黑曲霉的抑制作用

图1 茶树油浓度对黑曲霉菌丝生长的影响Fig.1 Effect of tea tree oil concentration on the growth of Aspergillus niger

采用菌丝生长速率抑菌率法检测不同香料的挥发性香氛对黑曲霉菌丝生长的抑菌率。由图1可知，培养1d后，0.1、0.2、0.4、0.6μL/cm3茶树油的抑菌率分别为78.7%、88.0%、91.6%、99.1%，表明茶树油对黑曲霉的抑制有浓度依赖性，浓度越高，初始抑菌率越高；而随着培养时间延长抑菌率逐渐降低，第5天时，0.1、0.2、0.4、0.6μL/cm3茶树油的抑菌率分别为20.1%、21.7%、33.7%、34.6%，表明茶树油挥发性香氛对黑曲霉的抑制效果持续性不长。

图2 柠檬醛浓度对黑曲霉菌丝生长的影响Fig.2 Effect of citral concentration on the growth of Aspergillus niger

由图2可知，柠檬醛挥发性香氛对黑曲霉有较好的抑制作用。当柠檬醛浓度为0.1μL/cm3时，第1天对黑曲霉的抑菌率达到100%，第2天开始抑菌率逐渐下降，第5天时为64.8%。0.2μL/cm3的柠檬醛在前2天都可以完全抑制黑曲霉，第3天开始抑菌率缓慢下降，第5天时为89.1%。0.3μL/cm3的柠檬醛在第4天开始未达到对黑曲霉的完全抑制。浓度为0.4μL/cm3时则实验期间抑菌率均为100%。

图3 丁香酚浓度对黑曲霉菌丝生长的影响Fig.3 Effect of eugenol concentration on the growth of Aspergillus niger

由图3可知，丁香酚的挥发性香氛对荔枝黑曲霉的抑菌率在这3种抑菌剂中最高，当丁香酚浓度为0.2μL/cm3时，实验第4天才观察记录到有菌丝的生长，第5天时抑菌率为92.1%；而0.3μL/cm3的丁香酚实验期间完全抑制黑曲霉的生长。

2.2 不同香料挥发性香氛的CMIC和CMBC分析

实验对不同香料挥发性香氛抑制黑曲霉的CMIC和CMBC进行检测和分析。茶树油在0.1～0.6μL/cm3浓度范围未检测到CMIC和CMBC值；丁香酚0.2μL/cm3浓度时在实验的第4天观察到菌丝增长。当丁香酚为0.3μL/cm3和0.4μL/cm3浓度时，在实验期间都没有菌丝增长；将这两组菌饼上的孢子接种到PDA培养基中连续培养5d后，发现霉菌孢子均没有萌发迹象，表明丁香酚的最低抑菌浓度和最低灭菌浓度均为0.3μL/cm3；柠檬醛在本次实验检测中CMIC和CMBC均为0.4μL/cm3。

2.3 香料的协同抑菌实验

利用L9(33)正交表进行试验设计，探讨茶树油、柠檬醛和丁香酚挥发性香氛的协同抑菌性，因素水平及结果见表1。

表1 正交试验及其结果分析Table 1 Results and analysis of orthogonal tests

由表1可知，各个香料添加量对抑菌率的影响大小为：茶树油浓度＞丁香酚浓度＞柠檬醛浓度，最佳配方为A3B2C3，即茶树油、柠檬醛、丁香酚浓度比为1:1:1。为进一步判断上述三因素对正交试验结果的影响是否存在，将正交试验数据进行方差分析。

由表2可知，当可信度为95%，误差所在列为因素B(柠檬醛浓度)时，因素A(茶树油浓度)和因素C(丁香酚浓度)对抑菌率的影响显著，表明茶树油和丁香酚的含量对复配香料液的抑菌性起主要作用。

表2 方差分析Table 2 Variance analysis

对复合香料的最佳配比进行验证，实验重复3次，得到的黑曲霉抑菌率分别为97.8%、98.5%、97.7%，其平均值为98.0%，RSD值为0.4%。验证实验的结果表明，复合香料中茶树油、柠檬醛、丁香酚的浓度比为1:1:1时，0.2μL/cm3的挥发性香氛抑制黑曲霉效果明显，第5天时抑菌率为98%，高于茶树油、柠檬醛、丁香酚单独使用时的21.7%、89.1%、92.1%，可见3种香料具有明显的协同增效作用。

3 结 论

将具有抗菌作用的植物作为抗菌药物使用已有很长的历史，部分植物精油的抗菌特性也已被人们所认知。茶树油是由桃金娘科白千层属灌木树种互叶白千层的新鲜枝叶经过水蒸气蒸馏得到的挥发性芳香精油[14]。近年来对茶树油的研究表明，茶树油具有良好的抗真菌[15]活性，温和无刺激[16]，美国已经批准茶树油作为食品香料使用，FEMA号为3902[9]。丁香酚和柠檬醛都为单离食用香料，分别分离自常用的食用香料丁香和柠檬草[17]。丁香酚(4-烯丙基-2-甲氧基苯酚)是丁香挥发油中的主要成分，为有机酚类，具有较好的挥发性，可以作用于微生物细胞膜的蛋白质和脂质，对真菌具有较强的抑制作用[18]。柠檬醛是柠檬草挥发油和山苍子挥发油中的主要成分[19]，有破坏真菌质膜的作用[8]，在食品、医疗卫生领域的应用显示其对真菌有较好的抑制效果。

本实验中，茶树油挥发性香氛在0.1～0.6μL/cm3的浓度范围内对荔枝黑曲霉的抑菌效果持续性稍差。丁香酚和柠檬醛的挥发性香氛对黑曲霉有较强的抑制和杀灭作用，CMIC分别为0.3μL/cm3和0.4μL/cm，CMBC分别为0.3μL/cm3和0.4μL/cm3。茶树油与丁香酚和柠檬醛复配后协同抑菌作用显著增强，且效果持久；当复合香料中茶树油、柠檬醛、丁香酚的浓度比为1:1:1时，0.2μL/cm3的挥发性香氛抑制黑曲霉效果明显，第5天时抑菌率为98%，高于相同浓度的茶树油、柠檬醛、丁香酚单独使用时抑菌率。

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Inhibitory Effects of Tea Tree Oil, Eugenol and Citral on Aspergillus niger in Litchi

ZHONG Ye-jun1，XU Xin-yuan1，LIU Cheng-mei1,*，SUN Jian2，WU Jian-yong1，LIU Tao-ying1
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. Institute of Agro-food Science and Technology, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning 530007, China)

The inhibitory and synergistic inhibitory effects of volatile aromatic components from tea tree oil, eugenol and citral on rot-causing fungi such as Aspergillus niger in litchi were studied. The results showed that the volatile aromatic components from eugenol and citral had strong inhibitory effect on Aspergillus niger with minimum inhibition concentrations of 0.3 μL/cm3(air volume) and 0.4 μL/cm3(air volume), respectively. The anti-fungal effect of tea tree oil was weak, while its inhibitory effect could be enhanced in the attendance of eugenol and citral.

tea tree oil；eugenol；citral；Aspergillus niger；bacteriostasis

TS201.6

A

1002-6630(2012)11-0021-04

2011-07-04

广西科学研究与技术开发计划项目(桂科攻10100009-2)

钟业俊(1982—)，男，助理研究员，博士，研究方向为食品科学。E-mail：zhongyejun@ncu.edu.cn

*通信作者：刘成梅(1963—)，男，教授，博士，研究方向为食品科学。E-mail：chengmeiliu@yahoo.com.cn