超临界CO2密度对全反式番茄红素吸光系数的影响

何强强，惠伯棣，宫 平

超临界CO2密度对全反式番茄红素吸光系数的影响

何强强，惠伯棣*，宫 平

(北京联合大学应用文理学院， 北京 100191)

目的:通过在超临界CO2色谱上测定CO2流动相密度与全反式番茄红素组分峰面积的相关性，推算二氧化碳密度变化对全反式番茄红素的吸光系数的影响。方法:超临界色谱条件:色谱柱:Diamonsil C8(250mm× 4.6mm，5μm)；检测波长:453nm；压力变化范围:11.5～17.5MPa；温度变化范围:35～55℃；流速: 2mL/min；进样量:20μL。结果:全反式番茄红素组分在超临界CO2中最大吸收波长处的峰面积是可变的，与CO2密度呈线性正相关。结论:可推断全反式番茄红素吸光系数与超临界CO2流体密度变化呈正相关。

全反式番茄红素；超临界流体色谱；超临界CO2；密度；吸光系数

番茄红素(lycopene)是一种胡萝卜素(carotene)，系统命名为ψ,ψ-胡萝卜素(ψ,ψ-carotene)，分子式为C40H56，相对分子质量为536.85。番茄红素的分子由多聚烯链构成，含11个共轭双键和2个非共轭双键，末端无芳香环，为开环结构。由于分子中存在多个双键，番茄红素普遍存在几何异构现象。天然来源的番茄红素主要以全反式(all E-isomer)的形式存在(图1)，是最稳定的一种构型。在目前的研究工作中，反式异构体的性质是关注的重点[1-4]。

超临界流体是物质处于临界压力和临界温度之上的一种状态。超临界流体技术(包括超临界流体萃取和色谱)已被大量应用于类胡萝卜素的制备和分析上[5-6]。由我国新疆红帆生物科技有限公司研发的世界上第一条应用超临界CO2为第一萃取溶媒从番茄果皮中萃取天然番茄红素的生产线在我国新疆维吾尔自治区巴音郭楞蒙古自治州已经运行了6年[7]。以番茄红素为功能因子的保健食品和食品添加剂产品在我国市场上呈畅销趋势。在这些应用中，类胡萝卜素的检测主要依靠其在紫外-可见区的吸收光谱(电子吸收光谱)。因此，研究超临界流体溶媒对类胡萝卜素(尤其是番茄红素)电子吸收光谱的影响具有十分现实的意义。

在这一领域的研究始于20世纪90年代初期，由惠伯棣等[8]报道。到目前为止，惠伯棣等[1,2,6,8]所报道的结果包括:1)在超临界CO2中，番茄红素和β-胡萝卜素的最大吸收波长较其在有机溶剂中的小；2)二者的最大吸收波长与CO2密度呈正相关；3)二者的跃迁能与CO2的极化率呈负线性相关[9]。在方法上，由惠伯棣等进行的番茄红素在超临界CO2流体中电子吸收光谱的研究工作均使用的是流动检测设备。与使用静态电子吸收光谱收集设备的方法相比，这种方法所需的设备较为普及，一般耐高压的液相色谱检测器即可。所得数据重复性较好，经统计学分析后具有较好的置信度。

本项研究的目的为:根据在超临界CO2色谱上测定的CO2流动相密度与全反式番茄红素组分峰面积的相关性，推算CO2密度变化对全反式番茄红素的吸光系数的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

DSM redivivoTM全反式番茄红素样品(番茄红素含量≥10%) 瑞典帝斯曼公司。该产品为人工合成全反式番茄红素的微结晶油悬浮物，含有少量的α-生育酚。使用前应用UV-Vis法对其中总番茄红素含量进行标定[10]，标定含量为质量分数10.03%。随后应用C30-HPLCPDA对其几何异构体组成进行了分析[4,11]。分析结果表明:该样品中全反式异构体的含量超过97%。

CO2(纯度为99.9%) 北京气体公司；乙腈、甲醇(色谱纯) 美国迪马公司；二氯甲烷、正己烷、N,N-二异丙基乙胺(分析纯) 美国JK化学品公司。

1.2 仪器与设备

图2 超临界CO2流体色谱仪Fig.2 Flow chart of supercritical carbon dioxide fluid chromatography

超临界流体色谱设备(该系统由CO2源、CO2泵、夹带剂泵、进样器、紫外-可见光检测器(具扫描功能)、尾压阀及控制器和数据采集设备组成，详见图2)、HPLC设备(PU-2080 Plus智能输送泵、CO2输送泵PU-1580-CO2、尾压控制器BP-1580-81、检温箱CO-2065 Plus)日本分光(Jasco)公司、N2000色谱数据工作站 浙大智达公司；Diamonsil C8色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)美国迪马公司。Multi Spec-1501紫外-可见光分光光度计 日本岛津公司；Waters PDA-2996二极管阵列检测器 美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 样品溶液的配制

将样品在开启前置于40℃水浴中15min，并不时摇动，使样品具有一定流动性。开封后迅速称取0.1775g样品于10mL棕色容量瓶中，用二氯甲烷溶解并定容，制成0.01775g/mL的样品储备液。储备液贮存于－80℃冰箱中，于48h内使用完毕。根据各实验的需要用贮备液配制成不同质量浓度的工作液。

1.3.2 色谱操作

1.3.2.1 超临界流体色谱

由于样品中番茄红素的含量仅为10%，因此，在采集组分的电子吸收光谱前，需经过色谱的分离和纯化过程，以确保组分在被收集光谱时处于纯度较高的状态。同时，在采集样品组分的光谱时，组分的溶媒也必须单一，为超临界态的CO2。否则，组分的吸光强度会受到干扰。因此，在采集光谱前，使用了C8固定相对组分进行了超临界流体色谱纯化。组分的色谱纯化及光谱采集过程操作如下:关闭阀门-2，打开阀门-1，打开气瓶阀门。打开C O2泵的制冷机电源，等待约30min，待绿色指示灯亮后，打开所有设备的电源。设定柱温箱温度为45℃，开启反压阀。约10min后，系统中空气排尽。随后，设定CO2泵的流速为2mL/min，反压阀调控方式为恒流模式。在所有的实验中，样品导入体积均为20mL。

在色谱柱载量测定中，设定压力为13MPa，柱温箱温度为45℃。根据之前研究[8-9]，检测波长设定为453nm。

在压力变化研究中，设定压力分别为11.5、13、14.5、16、17.5MPa，柱温箱温度为45℃。检测波长设定为453nm。样品导入量为1.2μg。

在温度变化研究中，设定压力为13MPa，柱温箱温度分别为35、40、45、50、52℃。检测波长设定为453nm。样品导入量为1.2μg。

1.3.2.2 高压液相色谱

色谱条件:流速:0.7mL/min；温度:室温25℃；流动相:乙腈-甲醇-二氯甲烷-正己烷-N-乙基-迪索丙胺(850:100:25:25:0.5，V/V)；检测波长:470nm；样品导入量:1.2μg。

1.4 数据处理

色谱系统在使用前用番茄红素样品进行重复性测试，6次进样中番茄红素组分峰面积的RSD≤3%。在实验中，每个样品重复进样3次以上，直到采集到RSD小于3%的平行数据。

2 结果与分析

2.1 全反式番茄红素的超临界CO2色谱行为

Jasco UV 2705 Plus Intelligent UV-Vis型检测器具有进行实时光谱扫描的功能。因此，全反式番茄红素组分的超临界CO2色谱行为如图3所示。

图3 全反式番茄红素组分的超临界二氧化碳色谱行为Fig.3 Supercritical carbon dioxide chromatographic profile of alltrans lycopene fraction

2.2 压力变化对保留时间的影响

图4 压力变化对全反式番茄红素组分保留时间的影响Fig.4 Effect of pressure on retention time of all-trans lycopene fraction

由图4可知，当CO2流动相的压力自11.5MPa升至17.5MPa时，全反式番茄红素组分在453nm波长处的保留时间呈缩短趋势。

2.3 温度变化对保留时间的影响

图5 温度变化对全反式番茄红素组分保留时间的影响Fig.5 Effect of temperature on retention time of all-trans lycopene fraction

由图5可知，当CO2流动相的温度自32℃升至52℃时，全反式番茄红素组分在13MPa压力和453nm波长处的保留时间呈延长趋势。

2.4 密度变化对保留时间的影响

由于超临界CO2流体的压力和温度变化会引起其密度的变化，可根据全反式番茄红素组分在453nm波长处的保留时间与CO2压力和温度变化的相关性(图4、5)，得到组分保留时间与CO2密度变化的相关性(图6)。

图6 CO2密度变化对全反式番茄红素组分保留时间的影响Fig.6 Effect of carbon dioxide density on retention time of all-trans lycopene fraction

2.5 色谱柱的最小检测限、载量与线性测定

在压力为13MPa、温度为45℃、流速为2mL/min、检测波长为453nm、进样体积为20μL时，本色谱系统的全反式番茄红素最小检出量为60ng。

本项研究的目的是在色谱系统上根据组分的峰面积推算全反式番茄红素的吸光系数，并观察色谱流动相条件的变化对吸光系数的影响。因此，样品进样量与组分峰面积的线性相关是保证实验结果准确性的必要条件。由图7可知，当样品量在0～11.836μg时，样品进样量与组分峰面积可以被认为呈线性相关(R2＝0.9967)。色谱柱的载量值＞15μg。

图7 样品进样量对全反式番茄红素组分峰面积的影响Fig.7 Effect of sample loading amount on fraction peak area

2.6 压力变化对峰面积的影响

图8 压力变化对全反式番茄红素组分峰面积的影响Fig.8 Effect of pressure on fraction peak area

在以下的实验中，进样量均为1.2μg，小于色谱柱的载量，以保证样品量与组分峰面积的线性关系。由图8可知，当CO2流动相的压力自11.5MPa升至17.5MPa时，全反式番茄红素组分在453nm波长的峰面积呈增加趋势。

2.7 温度变化对峰面积的影响

图9 温度变化对全反式番茄红素组分峰面积的影响Fig.9 Effect of temperature on fraction peak area

由图9可知，当CO2流动相的温度自32℃升至55℃时，全反式番茄红素组分在453nm波长的峰面积呈减少趋势。

2.8 CO2密度变化对峰面积的影响

如上所述，超临界CO2流体的压力和温度变化可引起其密度的变化。根据全反式番茄红素组分在453nm波长处的峰面积与CO2流动相压力和温度变化的相关性(图8、9)，其峰面积与CO2密度变化的相关性见图1 0。

图10 CO2密度变化对全反式番茄红素组分峰面积的影响Fig.10 Effect of CO2 density on fraction peak area

由图10可知，在0.53～0.75g/mL范围内，当超临界CO2密度增加时，其中全反式番茄红素组分的峰面积呈增加趋势。本项研究所得数据表明:关于超临界CO2密度与组分峰面积的数量相关性尚不能确定。但在这个密度范围内，其R2＝0.9075。如要确定二者的关系，需扩大检测密度的范围。即使如此，在本项研究中，亦可根据所得二者的线性关系推算了在不同CO2密度条件下的全反式番茄红素组分吸光系数。

2.9 全反式番茄红素组分在HPLC流动相中的吸光系数测定与计算

在本项研究中，也对1.2μg全反式番茄红素组分在乙腈为主的流动相(乙腈体积分数85%)中的峰面积进行了测定。随后，在UV-Vis上，根据惠伯棣等[8]报道的方法，测定了该组分在流动相中的值为3430。

虽然根据本项实验的结果，超临界CO2密度与组分峰面积的数量相关性尚不能确定。但在这个密度范围内，线性回归方程为:

式中:x为超临界CO2密度/(g/mL)；y为全反式番茄红素组分峰面积/(mV·s)。

其中:R2＝0.9075。在本项研究中，根据所回归的线性关系按式(2)推算全反式番茄红素组分在密度为0.53～0.75g/mL范围内超临界CO2流体中的吸光系数结果见表1。

式中:ASF为全反式番茄红素组分在超临界CO2流体中的吸光系数AHPLC为全反式番茄红素组分在HPLC流动相中的吸光系数(A)；SSF为全反式番茄红素组分在超临界CO2流体中的峰面积/(mV·s)；SHPLC为全反式番茄红素组分在H PLC流动相中的峰面积/(mV·s)。

表1 溶媒密度变化对全反式番茄红素吸光系数化的影响Table 1 The influence of variation in medium density on variation in all E-lycopene absorption coefficient

表1 溶媒密度变化对全反式番茄红素吸光系数化的影响Table 1 The influence of variation in medium density on variation in all E-lycopene absorption coefficient

溶媒名称密度/(g/mL)吸光系数(A1cm)状态HPLC流动相0.7903430液态0.7572238超临界态0.7502221超临界态0.7272165超临界态超临界CO20.6992098超临界态0.6912078超临界态0.6441964超临界态0.5861823超临界态0.5781804超临界态1%

3 结 论

本项研究的结果表明:全反式番茄红素组分在超临界CO2色谱中最大吸收波长下的峰面积是可变的，与CO2密度呈线性正相关。由此，可以得出结论:全反式番茄红素的吸光系数与超临界CO2流体密度变化呈线形正相关。

[1]惠伯棣. 类胡萝卜素化学与生物化学[M]. 北京: 中国轻工出版社, 2005: 261-266.

[2]惠伯棣, 朱蕾, 欧阳清波, 等. 类胡萝卜素的命名[J]. 中国食品添加剂, 2003(4): 48-54.

[3]李京, 惠伯棣, 裴凌鹏. 番茄红素: 被关注的功能因子[J]. 食品科学, 2005, 26(8): 461-464.

[4]李京, 惠伯棣. 番茄红素在体内代谢中的几何异构体组成变化[J]. 食品科学, 2008, 29(9): 591-594.

[5]FAVATI P, KING J W, FRIEDRICH J P, et al. Supercritical CO2 extraction of carotene and lutein from leaf protein concentrate[J]. Food Science, 1988, 53(5): 1532-1536.

[6]惠伯棣. 胡萝卜素、叶黄素和叶绿素在反相超临界色谱中的分离初探[J]. 食品科学, 2005, 26(8): 162-166.

[7]庞善春, 惠伯棣, 刘沐霖. 天然番茄红素软胶囊的生产工艺和质量控制点分析[J]. 食品科学, 2007, 28(8): 619-624.

[8]HUI Bodi, YOUNG A J, BOOTH L A, et al. Detection of carotenoids on supercritical fluid chromatography (SFC). A preliminary investigation on the spectral shifts of carotenoids in supercritical carbon dioxide[J]. Chromatographic, 1994, 39(9/10): 549-556.

[9]惠伯棣. 超临界CO2中全反式β,β-和ψ,ψ-胡萝卜素的电子吸收光谱位移研究[J]. 食品科学, 2008, 29(10): 125-128.

[10]白鸿. 保健食品功能因子检测[M]. 北京: 中国中医药出版社, 2011: 270-273.

[11]李京, 惠伯棣. 秋橄榄果实中番茄红素含量与几何异构体组成分析[J]. 食品工业科技, 2006, 27(10): 64-65.

Effect of Supercritical Carbon Dioxide Density on Absorption Coefficient of All-trans Lycopene

HE Qiang-qiang，HUI Bo-di*，GONG Ping (College of Applied Arts and Science, Beijing Union University, Beijing 100191, China)

Objective: To assess the effect of varying carbon dioxide density on absorption coefficientof all-trans lycopene through exploring the correlation between carbon dioxide density in supercritical fluid chromatography (SFC) and peak areas of all-trans lycopene fractions. Methods: Supercritical CO2fluid chromatography was carried out on a Diamonsil C8(250mm × 4.6 mm, 5 μm, ) at a pressure ranging from 11.5 to 17.5 MPa, and a temperature ranging from 35—55 ℃. The detection wavelength was 453 nm, and 20 μL sample was injected for SFC chromatography. Results: Peak area of all-trans lycopene at the maximum absorption wavelength in supercritical carbon dioxide fluid chromatography revealed a variation and was linearly positive correlated with the density of carbon dioxide. Conclusion: Absorption coefficient of all-trans lycopene is positively correlated with the density of supercritical carbon dioxide.

all-trans lycopene；supercritical fluid chromatography (SFC)；supercritical carbon dioxide；density；absorption coefficient

TS207.3

A

1002-6630(2012)15-0052-05

2011-07-04

“十一五”国家科技支撑计划项目(2008BAI58B06)；2010年北京联合大学“创新人才建设计划”项目(2010-05-20)

何强强(1986—)，男，硕士研究生，研究方向为生物活性物质制备及天然产物化学。E-mail:8075874@163.com

*通信作者:惠伯棣(1959—)，男，教授，博士，研究方向为类胡萝卜素化学及生物化学。E-mail:bodi_hui@ygi.edu.cn