酶解脱脂蚕蛹蛋白制备ACE抑制肽

李 勇，王 颖，黄先智，阚建全,*，晋圣坤，贺亚萍，胡益侨，廖 晨

(1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.重庆市农产品加工及贮藏重点实验室，重庆 400715；3.西南大学生物技术学院，重庆 400715)

酶解脱脂蚕蛹蛋白制备ACE抑制肽

李 勇1,2，王 颖1,2，黄先智3，阚建全1,2,*，晋圣坤1，贺亚萍1,2，胡益侨1,2，廖 晨1,2

(1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.重庆市农产品加工及贮藏重点实验室，重庆 400715；3.西南大学生物技术学院，重庆 400715)

以实验室自制的脱脂蚕蛹蛋白为原料，利用酶工程技术，通过对中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶等的筛选及单因素和响应面优化试验，对ACE抑制肽的制备工艺条件进行较系统的研究。结果表明：选择碱性蛋白酶作为脱脂蚕蛹蛋白制备ACE抑制肽的酶，制备ACE抑制肽的最佳工艺条件为料液比11.88:100、温度50.22℃、pH 9.46、加酶量7.03%、酶解4h。在此条件下制备的ACE抑制肽的ACE抑制率达到41.98%。

蚕蛹蛋白；ACE抑制肽；酶解；工艺条件

血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme，ACE)在人体血压形成过程中起重要作用，它催化血管紧张素Ⅰ从C端裂解二肽形成血管紧张素Ⅱ(肾素-血管紧张素系统中已知最强的血管收缩剂)。同时，它能阻抗血管舒张剂——舒缓激肽的降解[1]，抑制ACE的活性，可使血管紧张素Ⅱ的生成和激肽的破坏均减少，从而达到治疗高血压的目的。目前已从许多食源性蛋白质中分离得到了ACE抑制肽，如牛乳酪蛋白[2]、沙丁鱼[3]、大豆蛋白[4]、花生蛋白[5]、向日葵蛋白[6]等。

蚕蛹(silkworm pupa)含有丰富的蛋白质，目前已有报道利用其制备蛋白小肽[7-8]。闵建华等[7]采用碱性蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶水解蚕蛹蛋白，并研究了其产物的抗氧化活性。陈静等[8]以脱脂蚕蛹蛋白为原料，采用碱性蛋白酶水解蚕蛹蛋白制备缓解体力疲劳的蛋白肽运动饮料。蚕蛹丰富的蛋白质中疏水性氨基酸的含量比较高[9]，有研究表明，疏水性氨基酸能提高ACE抑制肽的活性[10-13]。因此，用蚕蛹作为开发ACE抑制肽的原料是可行的。本实验以脱脂蚕蛹蛋白作为原料，研究在酶解过程中其ACE抑制率的变化，确定酶解脱脂蚕蛹蛋白制备ACE抑制肽的最佳工艺条件，以期为深入开发利用蚕蛹蛋白资源及蚕蛹蛋白深加工提供理论依据，为开发具有降血压效果的蚕蛹蛋白ACE抑制肽提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

脱脂蚕蛹蛋白粉，实验室采用索氏-无水乙醚抽提12h自制。

1.1.2 试剂

ACE、马尿酰-组胺酰-亮氨酸(HHL) 美国Sigma公司；Neutrase中性蛋白酶、Papain木瓜蛋白酶、A l c a l a s e碱性蛋白酶、P r o t a m e x复合蛋白酶、Flavourzyme风味蛋白酶 南宁东恒华道生物科技有限公司；Trypsin胰蛋白酶 北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

HH-6数显恒温水浴锅 金坛市富华仪器有限公司；PB-10酸度计 上海雷磁仪器厂；JA2003电子天平 上海精天电子仪器有限公司；DHG-9240电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司；ALPAAI-4LSC真空冷冻干燥机 美国Chris公司；Milli-Qbiocel超纯水机 美国密理博公司；1-15PK冷冻离心机 美国Sigma公司；LC-20AD 高效液相色谱仪 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 水解度(DH)的测定

在中性和碱性条件下采用pH-stat法[14]计算水解度，计算公式如式(1)所示。

式中：c、V分别为水解过程中所加NaOH的浓度/ (mol/L)和体积/mL；mp为原料中净蛋白质质量/g；htot为1g原料蛋白质中所含肽键的毫摩尔数，为7.8mmol/g pro；α为氨基的平均解离度，可按α＝10pH-pK/(1＋10pH-pK)计算。其中，pH为水解溶液的pH值；pK为α-氨基的解离度的负对数，此处取值为7.0。

1.3.2 ACE抑制率的测定[15]

在37℃反应体系中依次加入80μL HHL液、降血压肽液、超纯水，每次测试的总体积为0.2mL，把以上混合液放入37℃恒温水浴中保温3min，然后加入10μL ACE酶液启动反应，恒温保持30min后，加入0. 2mL 1mol/L HCl中止反应，至室温，取5μL反应产物进样，通过反相高效液相色谱洗脱图谱定量马尿酸的生成量，从而计算降血压肽的抑制率。对ACE 抑制率为50% 时的降血压肽浓度为半抑制浓度，即IC50。

式中：A1为不存在降血压肽时的峰面积；A2为存在降血压肽与酶时的峰面积。

测定ACE抑制率的色谱条件：检测器：SPD-M20A；色谱柱：岛津 VP-ODS (4.6mm×150mm)；洗脱液：25%乙腈-75% 超纯水；洗脱液流速：1mL/min；检测波长：228nm；进样量：5μL。

1.3.3 蛋白酶的选择

分别选用6种蛋白酶水解脱脂蚕蛹蛋白，反应在恒温水浴锅中进行。料液比1:20，加酶量2%，水解条件分别为：1)Neutrase中性蛋白酶：pH7.0、50℃；2) Papain木瓜蛋白酶：pH6.5、65℃；3)Alcalase碱性蛋白酶：pH8.0、50℃；4)Protamex复合蛋白酶：pH6.5、50℃；5)Flavourzyme风味蛋白酶：pH7.5、50℃；6) Trypsin胰蛋白酶：pH 7.5、50℃；酶解6h，计算水解度。取样，立即置于沸水浴中加热10min灭酶，流水冷却，水解物在5℃。8000r/min离心10min，收集上清液，用于ACE抑制活性的测定。

1.3.4 Alcalase碱性蛋白酶水解的单因素试验

料液比为1:20、加酶量为2%、温度50℃、pH8.0、酶解6h，并每隔1h取样品，分别测其ACE抑制率。

1.3.4.2 pH值对酶解效果的影响

料液比1:20、加酶量2%、温度50℃、酶解4h，调节pH值分别为8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，分别测酶解液的ACE抑制率。

1.3.4.3 料液比对酶解效果的影响

加酶量2%、pH9.0、酶解4h、温度50℃，料液比分别为3:50、9:100、3:25、3:20、9:50，分别测酶解液的ACE抑制率。

1.3.4.4 酶解温度对酶解效果的影响

料液比1:20、加酶量2%、pH9.0、酶解4h，酶解温度分别为45、50、55、60、65℃，分别测酶解液的ACE抑制率。

2.3.2 固定效应与随机效应的判定 需要通过Hausman检验(原假设为“随机影响模型中个体影响与解释变量不相关”)，进一步确定是选取固定效应模型还是随机效应模型．

1.3.4.5 加酶量对酶解效果的影响

料液比1:20、pH9.0、温度50℃、酶解4h，加酶量分别为3%、5%、7%、9%、11%，分别测酶解液的ACE抑制率。

1.3.5 Alcalase碱性蛋白酶的水解条件优化试验

根据单因素试验的结果，采用响应面优化试验设计，运用Box-Benhnken中心组合试验设计原理，选择对ACE抑制率有影响的4个因素：料液比、加酶量、pH值、温度，进行四因素三水平的响应面优化试验(表1)，以ACE抑制率作为响应变量。

表1 响应面优化试验因素与水平Table 1 Coded values and corresponding actual values of the hydrolysis conditions tested in response surface analysis

1.4 数据处理方法

实验数据均是经过3次平行实验得到的平均值，并计算其误差，使用Design Expert分析响应面数据。

2 结果与分析

2.1 酶解的单因素试验结果

2.1.1 不同蛋白酶对ACE抑制率及其水解度的影响

图1 6种酶解液的ACE抑制率及其水解度的比较Fig.1 ACE-inhibitory rates and hydrolysis degrees of pupa protein hydrolysates from 6 kinds of proteases

由图1可知，在酶解6h时，使用碱性蛋白酶的脱脂蚕蛹蛋白酶解液的ACE抑制率最高，达到了32.46%，这说明酶解得到的多肽具有抑制ACE酶活的作用。而使用胰蛋白酶的酶解液的水解度最高，达到25.66%，其酶解的程度较其他酶高，但其ACE抑制率只有4.87%，这说明其酶解生成的多肽大多不具有抑制ACE酶活性的作用。由此可看出ACE抑制率与水解度并没有相关性，这与前人的研究一致。因此，之后的研究就只以ACE抑制率为指标，筛选用碱性蛋白酶生产ACE抑制肽的工艺条件。

2.1.2 酶解时间对酶解液ACE抑制率的影响

由图2可知，在前3h内，ACE抑制率增加的趋势很快，到了3h后就比较平缓。4h时，ACE抑制率为32.09%，6h为32.46%，增加不明显。考虑生产成本，选择酶解4h作为后期实验的酶解时间。

图2 酶解时间对酶解液ACE抑制率的影响Fig.2 Effect of hydrolysis time on ACE-inhibitory rate of pupa protein hydrolysate

2.1.3 pH值对酶解液ACE抑制率的影响

pH值是酶反应的主要条件之一，最适pH值是酶促反应的重要参数。过酸过碱都会使酶的空间构象发生改变，使酶活降低，而且p H值可改变底物空间解离状态，影响与酶的结合。pH值对酶解液ACE抑制率的影响见图3。在pH9.5时，其ACE抑制率达到最高，为35.42%。随着pH值的继续增加，其ACE抑制率逐渐降低。因此，选取9.5作为其较佳的酶解pH值。

图3 pH值对酶解液ACE抑制率的影响Fig.3 Effect of hydrolysis pH on ACE-inhibitory rate of pupa protein hydrolysate

2.1.4 料液比对酶解液ACE抑制率的影响

图4 料液比对酶解液ACE抑制率的影响Fig.4 Effect of material/liquid ratio on ACE-inhibitory rate of pupa protein hydrolysate

由图4可知，随着料液比的增加，其ACE抑制率也逐渐增加，当料液比为3:25时，其ACE抑制率最高，为39.20%，之后又缓慢下降。因此，选取3:25作为其较佳的料液比。

2.1.5 酶解温度对酶解液ACE抑制率的影响

图5 酶解温度对酶解液ACE抑制率的影响Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on ACE-inhibitory rate of pupa protein hydrolysate

由图5可知，酶解温度对酶解液的ACE抑制率的影响呈现先升高后降低的趋势，当50℃时为最大值36.00%。因此，取酶解温度为50℃。

2.1.6 加酶量对酶解液ACE抑制率的影响

图6 加酶量对酶解液ACE抑制率的影响Fig.6 Effect of enzyme concentration on ACE-inhibitory rate of pupa protein hydrolysate

由图6可知，加酶量为5%～7%时，其酶解液的ACE抑制率逐渐变大，在7%时达到峰值35.92%，之后随着加酶量的继续增加，其抑制率却变小。因此，选取加酶量为7%。

2.2 响应面优化试验结果与分析

2.2.1 响应面优化试验

采用Box-Behnken设计，利用Design Expert 7.0软件对试验结果进行响应面分析(表2)，得出回归模型参数的方差分析，见表3。

表2 响应面分析方案及试验结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

表3 二次响应模型方差分析Table 3 ANOVA results obtained for the established regression model

由表3方差分析可知，模型的P值显著。失拟项P＝0.3276(＞0.05)，差异不显著，未知因素对试验结果干扰小，说明残差均由随机误差引起。R2＝0.9907，说明模型拟合程度良好，试验误差小，该模型能够反映响应值的变化。其二次方程为：

对表2的结果作响应面及其等高视线图，如图8～12所示，可以看出，任意两个因素间均存在比较明显的交互作用，最佳落点在试验考察的区域内。

图7 料液比和酶解温度相互作用对ACE抑制率影响的响应面和等高线Fig.7 Response surface and contour plots for the effect of material/ liquid ratio and hydrolysis temperature on ACE-inhibitory rate of pupa protein hydrolysate

图8 料液比和pH值相互作用对ACE抑制率影响的响应面和等高线Fig.8 Response surface and contour plots for the effect of material/ liquid ratio and enzymatic hydrolysis pH on ACE-inhibitory rate of pupa protein hydrolysate

图9 料液比和加酶量相互作用对ACE抑制率影响的响应面和等高线Fig.9 Response surface and contour plots for the effect of material/ liquid ratio and enzyme addition amount on ACE-inhibitory rate of pupa protein hydrolysate

图10 酶解温度和pH值相互作用对ACE抑制率影响的响应面和等高线Fig.10 Response surface and contour plots for the effect of hydrolysis temperature and enzymatic hydrolysis pH on ACE-inhibitory rate of pupa protein hydrolysate

图11 酶解温度和加酶量相互作用对ACE抑制率影响的响应面和等高线Fig.11 Response surface and contour plots for the effects of hydrolysis temperature and enzyme addition amount on ACE-inhibitory rate of pupa protein hydrolysate

图12 pH值和加酶量相互作用对ACE抑制率影响的响应面和等高线Fig.12 Response surface and contour plots for the effects of hydrolysis pH and enzyme addition amount on ACE-inhibitory rate of pupa protein hydrolysate

2.2.2 验证实验

利用Design Expert 7.0软件进行工艺参数的优化组合[16]，对优化工艺参数进行验证，在料液比11.88:100、酶解温度50.22℃、pH9.46、加酶量7.0 3%的条件下，所得ACE抑制胶A C E抑制率的预测值为42.09%，实际值为(41.98±0.06)%。

图13 HPLC测定脱脂蚕蛹多肽的ACE抑制活性色谱图Fig.13 HPLC chromatograms of pupa polypeptide with ACE inhibitory activity

脱脂蚕蛹多肽的ACE抑制活性HPLC色谱图如图13所示，与预测值基本一致，从而验证了回归方程的正确性，证明了实验设计与分析方法较为准确可靠。

3 结 论

比较了6种商业化蛋白酶水解脱脂蚕蛹蛋白所得水解产物的ACE抑制活性，结果表明：碱性蛋白酶为最适生产脱脂蚕蛹蛋白ACE抑制肽的生产用酶。对酶解条件进行优化，在料液比11.88:100、温度50.22℃、pH9.46、加酶量7.03%、水解4h时，脱脂蚕蛹蛋白酶解产物有最大ACE抑制活性，为41.98%。

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Enzymatic Preparation of ACE-Inhibitory Peptide from Pupa Protein

LI Yong1,2，WANG Ying1,2，HUANG Xian-zhi3，KAN Jian-quan1,2,*，JIN Sheng-kun1，HE Ya-ping1,2， HU Yi-qiao1,2，LIAO Chen1,2
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China；2. Chongqing Key Laboratory of Produce Processing and Storage, Chongqing 400715, China；3. College of Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China)

Defatted pupa protein was prepared in our laboratory and used further to prepare ACE-inhibitory peptide by enzymatic hydrolysis. The best protease for preparing ACE-inhibitory peptide from pupa protein was chosen out of neutral protease, alcalase, papain, protamex, flavourzyme and trypsin. The hydrolysis process was optimized using response surface methodology. Neutral protease was found to be the best among all investigated proteases. The optimal hydrolysis conditions were determined as follows: substrate concentration of 11.88:100, hydrolysis temperature of 50.22 ℃, hydrolysis pH of 9.46, and enzyme concentration of 7.03%, hydrolysis time of 4 h. Under these conditions, pupa protein hydrolysate with an ACE-inhibitory rate of 41.98% was obtained.

pupa protein；ACE-inhibitory peptide；enzymatic hydrolysis；process conditions

TS218

A

1002-6630(2012)11-0151-07

2011-06-06

国家现代农业(桑蚕)产业技术体系建设专项(CARS-22-ZJ0503)

李勇(1986—)，男，硕士研究生，研究方向为食品化学与营养学。E-mail：frog46@126.com

*通信作者：阚建全(1965—)，男，教授，博士，研究方向为食品化学与营养学、食品生物技术。E-mail：ganjq1965@163.com