自然发酵酸菜汁中乳杆菌的分离鉴定

武俊瑞，李 欣，张 苗，李晓忱，杨臣辰，岳喜庆

自然发酵酸菜汁中乳杆菌的分离鉴定

武俊瑞，李 欣，张 苗，李晓忱，杨臣辰，岳喜庆*

(沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866)

通过选择性培养和形态学观察，从分别采自辽宁省阜新、葫芦岛、兴城、营口、锦州的5份传统发酵酸菜汁中，分离纯化和筛选出4株具有耐酸特性的乳杆菌疑似菌株(HLD1-3、YK1-2、JZ6-3、XC4-4)，并对其进行运动性、过氧化氢酶、石蕊牛乳、明胶液化、不同温度生长、不同NaCl质量浓度生长、糖发酵实验等传统生理生化鉴定和16S rDNA序列分析，进一步鉴定其属种。二者结果均表明:4株耐酸乳酸菌均属于乳杆菌属，其中，HLD1-3和YK1-2属于乳杆菌属的清酒乳杆菌种，而JZ6-3和XC4-4属于乳杆菌属的植物乳杆菌种。由此可以推断，东北自然发酵酸菜可作为潜在益生乳酸菌分离筛选的资源库。

酸菜；耐酸；乳杆菌；分离鉴定

酸菜是将新鲜蔬菜经乳酸菌发酵等一系列的加工方法赋予其一定酸味口感和香气的发酵制品，有着悠久的制作和食用历史。自然发酵酸菜以酸鲜纯正、脆嫩芳香、清爽可口、解腻开胃、增进食欲等特点和功效深受人们的喜好，在我国，东北传统发酵酸菜闻名遐迩[1-2]。其中蕴藏着丰富的乳酸菌资源，近年来受到了食品行业的广泛关注[1-4]。

本实验拟通过选择性培养和形态学观察，从采自辽宁省阜新、葫芦岛、兴城、营口、锦州等地的5份传统发酵酸菜汁中，分离纯化和筛选出4株具有耐酸特性的乳杆菌疑似菌株，并对其进行生理生化鉴定和16S rDNA序列分析，进一步鉴定其属种，为进一步进行深入研究和开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

采自阜新、葫芦岛、兴城、营口和锦州农家自制传统发酵酸菜汁样品各1份，共5份。

培养基:MRS培养基、PY培养基、PYG培养基、明胶基础培养基。

细菌基因组DNA小量制备试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、Taq DNA聚合酶、DNA Marker 上海桑尼生物科技有限公司；革兰氏染色液、过氧化氢、葡萄糖、琼脂、石蕊、明胶等。

1.2 仪器与设备

2720型Thermal cycler PCR仪、3730-XL型测序仪美国ABI公司；5804R型离心机 德国Eppendorf公司；Tanon 2500凝胶成像系统 中国天能公司；ZMB-300E显微镜 上海宙山精密光学仪器有限公司；TGL-16C离心机 上海安亭科学仪器厂；电热手提式高压杀菌锅 上海医用核子仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 采样

在辽宁省阜新、葫芦岛、兴城、营口、锦州等地的农家，采集采用传统方法发酵的酸菜汁250mL，同时测定样品pH值和温度，并记录发酵过程及时间等信息，置于冰盒中运回实验室，于－60℃超低温冰箱中贮存备用。

1.3.2 样品的分离纯化

采用倾注培养法，对样品中的乳酸菌进行分离纯化。吸取1mL酸菜汁样品，接种于20mL添加了CaCO3的灭菌MRS固体培养基中，灭菌后MRS固体培养基在接种前要提前降温至55℃并保持恒定，待琼脂冷却凝固后，放入厌氧发生器中，于30℃培养24～48h。挑取有Ca圈并且直径在1～2mm的单菌落，在灭菌后MRS固体培养基上划线分离，于30℃培养24～48h，如此反复划线分离2～3次，直到确定为单菌落后编号，分别于10倍放大镜下进行菌落形态学观察，再挑取单个菌落，进行革兰氏染色，于100倍光学显微镜下进行菌体形态学观察，并记录。

1.3.3 耐酸菌株的初步筛选[5-6]

分别将分离纯化的12株待测菌株接种于pH值为3.0的MRS液体培养基中，于37℃的恒温培养箱中培养24～48h，观察菌株生长情况，能够生长的初步判定为耐酸菌株。

1.3.4 生理生化鉴定[7-9]

1.3.4.1 过氧化氢酶实验

用接种环挑取单个菌落，涂抹于已滴有15g/100mL H2O2的干净载玻片上，观察有无气泡产生，如无气泡产生即为H2O2酶阴性反应。

1.3.4.2 葡萄糖产气实验

将耐酸菌株分别用接种于装有倒置杜氏小管的PYG液体培养基中，于37℃的恒温条件下培养24～48h，每天用肉眼观察杜氏小管中有无气泡产生，如果有气泡产生则判定菌株为异型发酵阳性反应。

1.3.4.3 运动性实验

将耐酸菌株分别用接种针穿刺接种于MRS半固体培养基中，以不接种试管作空白对照，于37℃培养24～48h，观察菌落分布状况，如果只是沿穿刺线生长，而不向外扩散，则判定该菌株无运动性，反之则判定为有运动性。

1.3.4.4 石蕊牛乳实验

向脱脂牛奶中加入40mL质量浓度为25g/L的石蕊，混合均匀后分装试管，115℃高压蒸汽灭菌7min。最后在37℃培养24～48h，观察石蕊牛乳的凝固反应。

1.3.4.5 明胶液化实验

将供试菌株接种于灭菌的明胶基础培养基中，以不接种试管作空白对照，于37℃培养24～48h，在低温条件下观察结果。当对照管凝固、接种管液化时，为阳性。

1.3.4.6 不同温度生长实验

将供试菌株接种于MRS液体培养基中，以不接种试管作空白对照，分别置于15℃和45℃培养箱中培养2～4d，观察菌株生长情况。

1.3.4.7 不同NaCl质量浓度生长实验

将供试菌株接种于灭菌的且分别含有4、6.5、15g/100mL的NaCl的MRS液体培养基中，以不接种试管作空白对照，于37℃培养24～48h，观察菌株生长情况。

1.3.4.8 糖发酵实验

将供试菌株分别接种于含葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、甘露醇、半乳糖和海藻糖的PY基础培养基中，分别以不接种的作空白对照，于37℃培养24～48h，观察各试管颜色是否变黄。

1.3.4.9 利用16S rDNA序列分析进行鉴定[10-13]

总DNA的提取及纯度的检测:采用CTAB法提取供试菌株基因组DNA。使用ND-1000型微量紫外分光光度计检测基因组DNA的浓度以及OD260nm/OD280nm比值，再用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

16S rDNA 序列的PCR扩增:16S rDNA扩增引物:采用细菌通用引物，正向引物为27f(对应于Escherichia coli 8～27位碱基):5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物为1495r(对应于Escherichia coli 1495～1515位碱基):5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。

PCR扩增反应体系(25μL):上下游引物各1μL (10pmol/μL)，模板DNA (100ng/μL) 1μL，10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP MIX 2μL，超纯水17.2μL，rTaq酶0.3μL。

PCR扩增反应程序为:94℃预变性5min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸2min，循环30次；72℃延伸10min，4℃保温。

检测16S rDNA 扩增片段:扩增反应完毕后，利用1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。

16S rDNA 序列测定和构建系统发育树:供试菌株PCR扩增产物测序由上海桑尼生物技术有限公司完成。得到的序列运用Clust X软件校准 排齐后，在GenBank/ EMBL/DDBJ 数据库中进行BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)同源性比对分析。以16S rDNA的序列同源性大于99%为标准进行属种归类。然后再对待测菌株与模式菌株16S rDNA序列利用程序MEGA 5.0中的Neighbor-Joining法构建系统发育树，进一步进行种属鉴定。

2 结果与分析

2.1 样品采集

表1 样品采集情况Table 1 Information about pickle samples collected from 5 different regions

由表1可知，采集的5份样品采集时的地点、温度、pH值和发酵时间各不相同，样品温度在1.5～14.5℃之间，差异较大。样品pH值在3.8～5.8之间，属于偏酸性，发酵时间在70～120d之间，腌制的时间也不完全相同。

2.2 乳酸菌的分离及耐酸菌株初步筛选

通过选择性培养和菌落及菌体形态学观察，从5份自然发酵的酸菜汁中共分离得到12株革兰氏染色阳性的乳酸菌疑似菌株。进一步通过观察12株乳酸菌疑似菌株在pH值为3.0的MRS培养基中的生长情况，初步判定其是否耐酸，结果如表2所示。

表2 各菌株在pH值为3.0条件下的生长情况Table 2 Growth of 12 suspected Lactobacillus strains at pH 3.0

表3 供试菌株部分生理生化实验结果Table 3 Physiological and biochemical characteristics of 4 screened strains

由表2可知，在pH值为3.0的MRS培养基中，只有菌株HLD1-3、XC4-4、YK1-2和JZ6-3能够生长，其余菌株均不能生长，因此可以初步推断出HLD1-3、XC4-4、YK1-2和JZ6-3等4株菌对酸性环境具有较强的耐受性。

2.3 生理生化实验结果

对HLD1-3、XC4-4、YK1-2和JZ6-3这4株具有耐酸特性菌株，分别进行过氧化氢酶实验、石蕊牛乳实验、明胶液化实验、运动性实验、不同温度生长实验、不同NaCl质量质量浓度生长实验和糖发酵实验等生理生化鉴定，结果如见3、4。由表3可知，4株菌均表现为过氧化氢酶阴性，可初步判断为乳酸菌，且葡萄糖产气阴性，可排除异型发酵乳酸菌，其他特性分别为:运动性实验阴性、明胶液化实验阴性、石蕊牛乳实验阳性、在45℃生长良好、15℃条件下不能生长、在含15g/100mL NaCl的MRS培养基中无法生长、在NaCl质量浓度为4g/100mL时能正常生长，其中XC4-4和JZ6-3两株菌株在NaCl质量浓度为6.5g/100mL时仍然能够生长。

表4 糖发酵实验结果Table 4 Results of carbohydrate fermentation tests for 4 screened strains

由表4可知，XC4-4和JZ6-3均能利用选用的所有碳源；而HLD1-3和YK1-2则均不能利用甘露醇。

综合以上生理生化实验结果，根据《Bergey,s Manual of Systematic Bacteriology》[8]、《乳酸菌——生物学基础及试验方法》[9]，4株菌均为乳杆菌，其中，XC4-4和JZ6-3符合文献中描述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的特征，而HLD1-3和YK1-2则符合文献中描述清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)。

2.4 利用16S rDNA序列分析进行鉴定

用1%的琼脂糖凝胶电泳检测16S rDNA扩增产物，溴乙锭染色观察发现在1500bp处有荧光条带。经过序列测定，4株乳杆菌XC4-4、JZ6-3、HLD1-3和YK1-2的16S rDNA基因序列，长度分别为1447、1443、1450bp和1444bp。

利用BLAST软件，将菌株的16S rDNA序列与GenBank/EMBL/DDBJ数据库中已知的16S rDNA基因序列进行比对，菌株XC4-4和JZ6-3的16S rDNA序列与植物乳杆菌的16S rRNA/rDNA序列相似性为100%，菌株HLD1-3和YK1-2与清酒乳杆菌的同源性为100%。利用Mega 5.0软件构建系统发育树，结果如图1所示。菌株XC4-4和JZ6-3与植物乳杆菌的系统位置最接近，菌株HLD1-3和YK1-2则与清酒乳杆菌的系统位置最近，与干酪乳杆菌、短乳杆菌、开菲尔乳杆菌等在同一分支，同属于高温型乳酸菌，与嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌形成的同源簇有明显差异。综上，4株耐酸菌株均属于乳杆菌属，其中JZ6-3和XC4-4鉴定为乳杆菌属的植物乳杆菌种，HLD1-3和YK1-2则为乳杆菌属的清酒乳杆菌种。

图1 利用16S rDNA序列进行构建系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence

3 结 论

近年来，一些针对酸菜中乳酸菌的研究也日趋成熟。张鲁冀[1]、张杨[13]等从自然发酵酸菜汁中分离出10株乳杆菌，分别鉴定为短乳杆菌4株、植物乳杆菌3株、棒状乳杆菌1株、干酪乳杆菌1株和米酒乳杆菌1株。部分学者[2,13-16]则从自然发酵的酸菜汁中分离出3株高产酸菌株，分别鉴定为肠膜明串珠菌、短乳杆菌和植物乳酸杆菌，结果显示，植物乳杆菌可能是发酵酸菜的优势菌种，而从发酵酸菜汁中分离纯化清酒乳杆菌目前国内还未见报道。本研究从辽宁5个地区采集的5份传统发酵酸菜汁中分离纯化出12株乳酸菌疑似菌株，筛选出YK1-2、HLD1-3、XC4-4和JZ6-3共4株耐酸菌株，通过生理生化实验及16S rDNA序列分析，确定4株耐酸菌株均属于乳杆菌属，其中，HLD1-3和YK1-2属于乳杆菌属的清酒乳杆菌，而JZ6-3和XC4-4属于乳杆菌属的植物乳杆菌，可作为潜在益生菌株作进一步系统研究。该研究将为东北自然发酵酸菜中益生乳酸菌的分离筛选和进一步开发利用提供参考。

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Isolation and Identification of Lactobacillus Strains from Naturally Fermented Pickle Juice

WU Jun-rui，LI Xin，ZHANG Miao，LI Xiao-chen，YANG Chen-chen，YUE Xi-qing*
(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

Four acid-tolerant suspected Lactobacillus strains (HLD1-3, YK1-2, JZ6-3 and XC4-4) were isolated from five traditional pickle juices respectively collected from five regions of Liaoning province by selective cultivation and morphological observation. The four strains were identified based on physicochemical properties such as motility, catalase activity, litmus milk test, gelatin liquefaction test, growth under varying conditions of temperature NaCl concentration and carbohydrate fermentation tests and 16 S rDNA sequence analysis. The results indicated that all the strains belonged to the Lactobacillus genus. HLD1-3 and YK1-2 strains were identified as Lactobacillus sakei, while JZ6-3 and XC4-4 were identified as Lactobacillus plantarum. From these results, it can be speculated that naturally fermented pickle from Northeast China is a potential source of probiotic lactic acid bacteria.

pickle；acid tolerance；Lactobacillus；isolation

TS201.3

A

1002-6630(2012)15-0191-04

2011-07-01

国家自然科学基金项目(31000805)；国家“863”计划项目(2011AA100902)；辽宁省教育厅科学技术研究项目(L2012249)

武俊瑞(1977—)，男，讲师，博士，研究方向为动物性食品加工。E-mail:junruiwu@126.com

*通信作者:岳喜庆(1966—)，男，教授，博士，研究方向为动物性食品加工。E-mail:yxqsyau@126.com