7种食品防腐剂对肉制品污染微生物的抑菌效果比较研究

杨晓韬， 李 春,2， 周晓宏*

(1.石河子大学化学化工学院，新疆 石河子 832003；2.北京理工大学生命学院，北京 100081)

7种食品防腐剂对肉制品污染微生物的抑菌效果比较研究

杨晓韬1， 李 春1,2， 周晓宏2,*

(1.石河子大学化学化工学院，新疆 石河子 832003；2.北京理工大学生命学院，北京 100081)

通过测定抑菌率和最低抑菌质量浓度，研究化学防腐剂山梨酸钾、双乙酸钠、单辛酸甘油酯、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)以及生物防腐剂乳酸链球菌素(Nisin)、壳聚糖、ε-聚赖氨酸(ε-PL)对12株肉制品腐败(包括2株环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、3株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、3株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、2株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、1株蜂房哈夫尼亚菌(Hafnia alvei)以及1株肠球菌(Enterococcus))的抑菌活性。结果表明：7种防腐剂对供试菌都有一定的抑菌效果，抑菌效果强弱顺序为：Nisin＞壳聚糖＞ε-PL＞单辛酸甘油酯＞EDTA＞双乙酸钠＞山梨酸钾。3种生物防腐剂的抑菌效果明显强于其他4种化学防腐剂。通过比较各种防腐剂对不同种和同种不同株的细菌的抑菌效果，表明同一种防腐剂不仅对不同种的细菌抑菌效果不同，即使对同种不同株的细菌其抑菌效果也有很大差异。

食品防腐剂；肉制品腐败；抑菌效果

肉类制品具有极高的营养价值和独特的感官性质，能给人体提供必需的蛋白质、脂类、碳水化合物、无机盐及维生素等多种营养素，是人类膳食结构的重要组成部分[1]。随着人类食物品种的增多、销量的增长，危害肉类制品食品安全的因素也随之增多，使肉类制品食品安全问题日趋复杂，在众多导致肉类制品安全问题的因素中，微生物污染是最主要的因素[2]。因此防止肉类制品由微生物引起的腐败，增加其安全性，减少肉类制品因污染引起的浪费是肉制品加工企业必须解决的关键问题[3]。为了有效抑制肉制品中微生物的生长，延长肉制品的保质期，加强其安全性，在肉制品加工过程中，人们采用了许多不同的手段来杀死或者抑制微生物，其中添加防腐剂是最方便且有效的一种方法，因而被广泛使用于肉制品加工行业中[4]。

食品防腐剂，即用于防止食品因微生物引起的变质，提高食品保存性能，延长食品保质期而使用的食品添加剂[5]。我国现行的GB2760—2011《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》允许使用的防腐剂共有27种，其抑菌效果已有不少报道，但因各学者实验用菌种及其来源不同，即使用同一种菌，若菌株不同或已发生变异其结果也会不同[6]，且实验条件也不一致，因此难以从现有文献中全面衡量各种食品防腐剂对肉制品腐败菌的抑制作用。为此，本实验从不同来源的腐败肉制品中分离筛选出6种共12株细菌，研究7种常用的食品防腐剂对不同菌种以及同种不同株的细菌之间的抗菌活性差异，旨在为肉制品和其他食品的防腐提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山梨酸钾、双乙酸钠、EDTA(均为食品级) 北京北方霞光食品添加剂有限公司；单辛酸甘油酯 杭州康源食品科技有限公司；Nisin、ε-聚赖氨酸(ε-PL) 浙江银象生物工程有限公司；壳聚糖(脱乙酰度97.6%) 山东省莱州市海力生物制品有限公司；其余试剂均为分析纯。

2株环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、3株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、3株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、2株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、蜂房哈夫尼亚菌(Hafnia alvei)、肠球菌(Enterococcus)分离自不同来源的腐败肉制品。

1.2 方法

1.2.1 培养基的制备

肉制品模拟培养基(meat simulating medium，MSM)、肉制品模拟琼脂培养基(meat simulating and agar medium，MSMA)，是在刘坚真等[7-9]优化的测定食品细菌总数培养基配方的基础上，结合肉制品成分进一步优化的食品微生物通用培养基。MSM配方：酵母膏2.5g、牛肉膏1.0g、葡萄糖1.0g、胰蛋白胨5.0g、NaCl 8.5g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2，115℃灭菌20min。其中用酵母膏和牛肉膏模拟肉制品中的蛋白成分，用葡萄糖模拟肉制品中的淀粉等多糖成分。在MSM基础上添加15g/1000mL琼脂粉即为MSMA。

1.2.2 菌悬液的制备

将6种12株细菌(除蜂房哈夫尼亚菌为革兰氏阴性菌之外，其余5种均为革兰氏阳性菌)分别在MSMA斜面培养基上32℃条件下培养24h活化，活化后的菌种用接种环在斜面接一环于MSM中，在32℃条件下培养24h，采用平板计数法测定菌体浓度，将培养液稀释为含菌体107CFU/mL的菌悬液，4℃冰箱暂存备用。

1.2.3 抑菌活性的测定

首先将7种防腐剂配制成质量浓度分别为100、10、 1mg/mL的溶液，壳聚糖溶液中添加一定量的乳酸以使其溶解。Nisin溶液用无菌水在无菌操作台中配制，其余防腐剂溶液配好后经121℃灭菌20min， 4℃冰箱暂存备用。在含有8.9mL MSM的试管中，实验组加入1mL防腐剂溶液，0.1mL菌悬液；阳性对照组用无菌水取代防腐剂，阴性对照组用MSM取代菌液(用于比浊法调零，平板稀释法无阴性对照)。所有试管中的培养液总体积均为10mL，使各防腐剂的终质量浓度分别为10、1、0.1mg/mL。将体系充分混匀后于32℃条件下培养48h。取出试管，充分振荡，并对各试管进行逐个检查，用肉眼观察其混浊程度。

平板稀释法：用于单辛酸甘油酯、ε-PL、壳聚糖、Nisin抑菌活性的测定。将上述培养液经不同质量浓度稀释，各取0.1mL涂平板，32℃条件下培养24h，计数，与阳性对照比较，并以此表征防腐剂的抗菌活性。

比浊法：用于山梨酸钾、双乙酸钠、EDTA抑菌活性的测定。以阴性对照为空白参比，用紫外分光光度计于620nm波长处测定培养液的浊度(OD值)，与阳性对照比较，并以此表征防腐剂的抗菌活性。

平板稀释法抑菌率的计算[10]：

1.2.4 最低抑菌质量浓度(MIC)的测定

MIC的测定：首先根据防腐剂3种质量浓度(10、1、0.1mg/mL)的抑菌率初步确定其MIC的范围，在此范围内设定密集的质量浓度梯度并测定其抑菌率，选择抑菌率为100%的防腐剂质量浓度，即为防腐剂的最低抑菌质量浓度(MIC)[11]。

2 结果与分析

2.1 不同质量浓度的防腐剂对各种细菌的抑菌率

由图1～3可知，7种防腐剂对各种细菌都有一定的抑菌作用，且抑菌效果随着防腐剂质量浓度的增大而加强。总体来看，Nisin、壳聚糖和ε-PL的抑菌效果明显优于其他防腐剂，EDTA和单辛酸甘油酯次之，而山梨酸钾对6种供试菌的抑菌效果最不明显，低质量浓度时甚至有助于部分细菌(如肠球菌)的生长，双乙酸钠效果也不太好。值得关注的是Nisin对5种革兰氏阳性菌的抑菌效果十分明显，质量浓度为0.1mg/mL时，其抑菌率几乎都可以达到100%，但是对于革兰氏阴性的蜂房哈夫尼亚菌抑菌效果却只有2%，质量浓度为1mg/mL和10mg/mL时，其抑菌率也只能达到35%和75%；ε-PL也有和Nisin类似的趋势，只是程度不同而已；而壳聚糖对革兰氏阴性菌的抑菌效果最好，质量浓度为0.1mg/mL时，虽然其抑菌率只有39%，但在7种防腐剂中为最高，当质量浓度升高到1mg/mL时，其抑菌率已达到100%。

图1 质量浓度为0.1mg/mL的防腐剂对各种菌的抑菌效果Fig.1 Antibacterial activities of food preservatives at the concentration of 0.1 mg/mL against different species of bacteria

图2 质量浓度为1mg/mL的防腐剂对各种菌的抑菌效果Fig.2 Antibacterial activities of food preservatives at the concentration of 1 mg/mL against different species of bacteria

图3 质量浓度为10mg/mL的防腐剂对各种菌的抑菌效果Fig.3 Antibacterial activities of food preservatives at the concentration of 10 mg/mL against different species of bacteria

2.27 种食品防腐剂对同种不同株细菌的抑菌效果比较

2.2.17 种防腐剂对2株环状芽孢杆菌的抑菌效果

图4 质量浓度为0.1mg/mL的防腐剂对环状芽孢杆菌的抑菌效果Fig.4 Antibacterial activities of food preservatives at the concentration of 0.1 mg/mL against two different strains of Bacillus circulans

由图4可知，质量浓度为0.1mg/mL的7种防腐剂对环状芽孢杆菌的抑菌率大小为：Nisin、壳聚糖＞ε-PL＞单辛酸甘油酯＞ED TA＞双乙酸钠＞山梨酸钾。其中Nisin、壳聚糖对两株菌的抑菌率都为100%；单辛酸甘油酯、ε-PL和EDTA 3种防腐剂对环状芽孢杆菌-1和环状芽孢杆菌-2的抑菌效果有差异但不明显，抑菌率相差不超过5%；双乙酸钠对2株菌的抑菌效果相差较大，对环状芽孢杆菌-1的抑菌率不足15%，而对环状芽孢杆菌-2的抑菌率接近50%；而该质量浓度的山梨酸钾对2株菌都没有抑菌效果。

2.2.27 种防腐剂对2株凝结芽孢杆菌的抑菌效果

图5 质量浓度为0.1mg/mL的防腐剂对凝结芽孢杆菌的抑菌效果Fig.5 Antibacterial activities of food preservatives at the concentration of 0.1 mg/mL against two different strains of Bacillus coagulans

由图5可知，质量浓度为0.1mg/mL时，Nisin、壳聚糖、ε-PL对2株来源不同的凝结芽孢杆菌的抑菌率都达到100%；EDTA对两株菌的抑菌率分别接近90%和80%；双乙酸钠对凝结芽孢杆菌-1的抑菌率为0，对凝结芽孢杆菌-2只有微弱的抑菌效果；单辛酸甘油酯对凝结芽孢杆菌-1的抑菌率为0，但对凝结芽孢杆菌-2的抑菌率达到90%以上，差异巨大；而该质量浓度的山梨酸钾对2株菌同样没有抑菌效果。

2.2.37 种防腐剂分别对3株地衣芽孢杆菌的抑菌效果

图6 质量浓度为0.1mg/mL的防腐剂对地衣芽孢杆菌的抑菌效果Fig.6 Antibacterial activities of food preservatives at the concentration of 0.1 mg/mL against three different strains of Bacillus licheniformis

由图6可知，虽然3株地衣芽孢杆菌来源相同，但是结果表明，同种防腐剂对3株菌的抑菌效果依然有不同程度的差异。Nisin和ε-PL的抑菌率最高，在99%以上，且对3株菌的抑菌效果基本一致；壳聚糖和EDTA都有明显的抑菌效果，但是3株菌之间也一定的差异；而山梨酸钾、双乙酸钠、单辛酸甘油酯对3株菌的抑菌效果有很大差异，山梨酸钾对地衣芽孢杆菌-1的抑菌率超过80%，而对地衣芽孢杆菌-2和地衣芽孢杆菌-3却没有抑菌作用；相反，单辛酸甘油酯对地衣芽孢杆菌-1的抑菌率为0，但对地衣芽孢杆菌-2和地衣芽孢杆菌-3的抑菌率却都在97%以上。由此可见，即使是来源相同的同种不同株的细菌，同一种防腐剂对它们的抑菌效果往往也会出现明显的差别。

2.2.47 种防腐剂分别对3株枯草芽孢杆菌的抑菌效果

图7 质量浓度为0.1mg/mL的防腐剂对枯草芽孢杆菌的抑菌效果Fig.7 Antibacterial activities of food preservatives at the concentration of 0.1 mg/mL against three different strains of Bacillus subtilis

由图7可知，Nisin对枯草芽孢杆菌的抑菌效果最好，抑菌率都在98%以上；壳聚糖次于Nisin，但抑菌率也都超过92%；ε-PL虽不及Nisin和壳聚糖，但抑菌率也都在80%以上。而其余4种防腐剂的抑菌效果在3株菌之间都有较大的差异，虽然前2株菌来源相同，但山梨酸钾、双乙酸钠以及EDTA对二者的抑菌效果差异明显。

2.37 种食品防腐剂的最低抑菌质量浓度(MIC)分析

表1 7种食品防腐剂对细菌的MIC值Table 1 MICs of seven food preservatives against different species of bacteria mg/mL

表1为7种食品防腐剂对12株肉制品腐败菌的最低抑菌质量浓度测定结果，MIC值越低，相应食品防腐剂的抑菌作用越强。可以看出，Nisin对革兰氏阳性菌都有很强的抑菌作用，在7种防腐剂中，它的最低抑菌质量浓度都是最小的，但是对于革兰氏阴性的蜂房哈夫尼亚菌，它的抑菌效果却不明显；壳聚糖对革兰氏阳性菌的最小抑菌质量浓度虽然比Nisin略大，但优于其他防腐剂，尤其是Nisin抑菌效果不好的蜂房哈夫尼亚菌，壳聚糖对它的最低抑菌质量浓度是最小的。而山梨酸钾对各株菌的最小抑菌质量浓度明显高于其他防腐剂，其抑菌效果在7种防腐剂中是最差的，分析其原因可能有以下三方面：首先山梨酸钾对霉菌、酵母和好气性菌均有抑制作用，但对嫌气性芽孢形成菌与嗜酸乳杆菌则几乎无效[12]，即山梨酸钾并不是广谱的防腐剂；同时山梨酸钾属于酸性防腐剂，其防腐效果随pH值升高而降低，适用于pH5.5以下的食品防腐；此外山梨酸钾的抑菌作用比抗菌作用强，有研究表明将其加入已经污染了大量微生物的食品中，则基本无效[13]。

各防腐剂最低抑菌质量浓度综合排序：Nisin＜壳聚糖＜ε-PL＜单辛酸甘油酯＜EDTA＜双乙酸钠＜山梨酸钾。

2.4 Nisin、壳聚糖、ε-PL抑菌作用的构效分析

与其他4种化学防腐剂相比，3种生物防腐剂Nisin、壳聚糖、ε-PL使用剂量低且防腐效果好，同时具有安全、天然、健康的特点，因而倍受人们的关注[12]。

Nisin是一种两亲型，由34个氨基酸组成的带正电荷的小肽，可以作用在细胞壁带负电荷的阴离子成分上，如细胞壁的磷壁酸、糖醛酸、脂磷壁酸、酸性多糖或细胞膜的磷脂上，并形成孔状结构，引起细胞膜的渗漏，导致小分子质量的细胞成分如钾离子、氢离子、氨基酸、核苷酸(如ATP、ADP)等物质迅速流出，从而引起细胞死亡[13]。从Nisin的抑菌谱来看，Nisin对革兰氏阳性细菌的抑菌效果明显优于革兰氏阴性细菌。这是由于革兰氏阴性细菌的细胞壁肽聚糖含量少，但组成复杂。主要包括磷脂、蛋白质和脂多糖(LPS)等，十分致密，仅允许分子质量小于600D的分子通过。Nisin的分子质量为3500D左右，无法正常通过革兰氏阴性细菌细胞壁，因此也就无法达到细胞膜[14]。

壳聚糖是一种天然多聚阳离子生物多糖[15]，分子结构中含有羟基和氨基，因此，各分子之间能够形成氢键，并且氨基葡萄糖单体的C2位上的氨基在pH6以下时质子化后带有正电荷，因而可以与细胞表面上带有负电荷的分子基团相互作用而改变细胞的通透[16]，导致细菌细胞内组分如蛋白质与葡萄糖等的泄漏[16-18]，也有可能在细胞表面形成一层高分子膜，阻止了营养物质向细胞内的运输，从而起到抑菌杀菌作用[19-20]。

ε-PL呈高聚合多价阳离子态，其抑菌机理可能是由于它可以作用于生物膜系统和蛋白合成系统，与核糖体结合从而抑制蛋白和酶生物大分子的合成，结合在生物膜上的ε-PL破坏膜结构完整性，使细胞的选择性改变，引起细胞的物质、能量和信息传递中断，呼吸作用受到影响，细菌能量代谢和物质代谢破坏，能量物质ATP和还原物质NADH亏缺，合成代谢受阻，导致胞内溶酶体膜破裂而诱导微生物产生自溶作用，最终使细胞死亡[21]。

由于细菌表面均带负电荷，所以这3种防腐剂对大部分细菌具有较好的抑菌效果，是更加安全可靠的新一代食品防腐剂[22]。

3 讨 论

本实验对山梨酸钾、Nisin、壳聚糖等7种食品防腐剂进行了抑菌效果的比较研究。结果表明7种防腐剂对各种供试菌都有不同程度的抑菌效果，防腐剂质量浓度越高其抑菌效果越好。总体来看，7种供试防腐剂抑菌效果强弱顺序为：Nisin＞壳聚糖＞ε-PL＞单辛酸甘油酯＞EDTA＞双乙酸钠＞山梨酸钾。同一种防腐剂，特别是抑菌效果中等的防腐剂，不仅对不同种的细菌抑菌效果不同，而且对于同种不同株的细菌，其抑菌效果也不尽相同，甚至相差很大。因此，对于防腐剂的抑菌效果，不能单纯以菌种来定论，应具体到所涉及的每一株菌。对于大多数供试菌而言，Nisin、壳聚糖、ε-PL的抑菌效果最好，其最低抑菌质量浓度远远小于山梨酸钾。随着人们生活和消费水平的提高，人们对肉制品安全提出了更高的要求，肉制品加工企业为了顺应市场的变化，其产品也越来越向“绿色”和“天然”等方向转变[23]，本实验也进一步证明了生物防腐剂比化学防腐剂更为高效、广谱，因此，天然、安全的生物防腐剂将是未来防腐领域的重点。

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Comparison of Antibacterial Effects of Seven Food Preservatives on Spoilage Microorganisms in Meat

YANG Xiao-tao1，LI Chun1,2，ZHOU Xiao-hong2,*
(1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Shihezi University, Shihezi 832003, China；2. School of Life Science, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, China)

The antibacterial activities of food preservatives including potassium sorbate, sodium diacetate, capryl monoglyceride, disodium ethylene-diamine-tetraacetate (EDTA), nisin, chitosan and ε-polylysine (ε-PL) against 12 meat spoilage strains such as 2 Bacillus circulans strains, 3 Bacillus subtilis strains, 3 Bacillus licheniformis strains, 2 Bacillus coagulans strains, 1 Hafnia alvei strain and an Enterococcus strain were investigated based on inhibitory rate and minimum inhibitory concentration. The results showed that seven food preservatives had inhibitory effect on all tested bacteria at different levels. They could be ranked in decreasing order of antibacterial activity as follows: nisin＞chitosan ＞ε-PL＞capryl monoglyceride＞EDTA ＞sodium diacetate＞potassium sorbate. Three bio-preservatives including nisin, chitosan and ε-PL had better antibacterial activity than other four chemical preservatives. In addition, the antibacterial activity of 7 preservatives exhibited great differences among species and among different strains from the same species.

food preservative；meat spoilage；antibacterial activity

TS202.3

A

1002-6630(2012)11-0012-05

2011-06-07

“十二五”国家科技支撑计划项目(2011BAD23B01；2011BAC11B06)

杨晓韬(1985—)，女，硕士研究生，研究方向为食品添加剂生物技术。E-mail：yangxiaotao521@126.com

*通信作者：周晓宏(1965—)，男，副教授，博士，研究方向为食品生物技术。E-mail：zhouxh@bit.edu.cn