丙泊酚对LPS激活人体中性粒细胞释放炎性细胞因子的影响及机制研究

彭 生 汪 伟 李 炜 董 楠

1.江苏省无锡市第四人民医院麻醉科，江苏无锡 214062；2.江苏省血吸虫病防治研究所，江苏无锡 214064

中性粒细胞（PMN）是介导炎症反应的重要效应细胞。PMN激活后可以释放大量炎性细胞因子，炎性细胞因子又可延迟PMN凋亡，造成更多炎性细胞因子的释放。而过量的炎性细胞因子是ARDS及MODS发病的重要因素。因此阻断PMN的激活及其下游细胞因子的转录具有重要意义。丙泊酚是常用的静脉全麻药，在体动物研究显示其可以抑制PMN激活，减少炎性细胞因子的释放[1]。而对于人体PMN的作用研究报道较少。本文拟离体研究丙泊酚对激活状态下人体PMN释放细胞因子的变化，并初步探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

丙泊酚（阿斯利康公司赠予）；内毒素（E．ColiO55：B5，sigma公司，美国）；中性粒细胞分离液，淋巴细胞分离液（天津灏洋生物公司）；p65 antibody（Santa Cruz Inc.，美国）；TNF-a、IL-8 检测试剂盒（CST，Inc.，美国）。

1.2 PMN分离

20例健康志愿者，均经知情同意，确认没有血液病、免疫性疾病、慢性炎症、发热等情况，近期无手术、麻醉史，未服用过抗炎药物、免疫调节药物，无长期使用镇静药物的病史。年龄 21～28 岁，平均（24±3）岁，男女比例为 8/12，每人采取外周静脉血20 mL，加入20 U/mL肝素抗凝。1 200r/min，离心10 min，弃血浆层；加入淋巴细胞分离液后离心（2 000 r/min，20 min），弃单核细胞层、分离液层；剩余白细胞层和红细胞层中加入9 倍体积 0℃的 NH4Cl液（Cl：155 mmol/L，KHCO3：10 mmol/L，EDTA：0.1 mmol/L）充分均匀后0℃下静置7 min，再次离心（1 500 r/min，10 min），然后用 0.9%的生理盐水洗涤 2次，以RPMI 1640培养液悬浮细胞，使细胞浓度为1×107/mL。瑞氏染色证实其纯度＞95%，苔盼蓝排斥试验检测，活细胞＞98%。分组每例分离好的PMN分成5部分，分别置入培养板中，分别加入等量生理盐水（C组，对照组）、LPS组（终浓度为100ng/L）、LPS+丙泊酚 2μg/mL组（P1组）、LPS+丙泊酚 4 μg/mL 组（P2组）、LPS+丙泊酚8μg/mL组（P3组）。置入CO2培养箱中孵育（37℃，湿度 100%，5%的 CO2和 59%的空气）12 h。

分离PMN所用器具均经无热源处理，玻璃器皿经高压蒸汽消毒后，烘箱内200℃干烘2 h，塑料器具经高压蒸汽消毒后，90℃干烘 7 d。

1.3 检测指标

12 h后分离细胞，Western blotting方法检测核内p65含量；同时取细胞分离后的上清液，ELISA法检测TNF-α、IL-8表达。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 丙泊酚对LPS激活PMN释放炎性细胞因子的影响

PMN培养12 h后，上清液中TNF-α、IL-8含量在LPS组显著高于C组（P＜0.01）；加入不同浓度丙泊酚的P1、P2、P3组较LPS组均显著减少（P＜0.05、0.01），且具有剂量依赖性。见表1。

表1 中性粒细胞培养上清液TNF-α、IL-8含量（x±s）

2.2 丙泊酚对PMN核内p65含量的影响

相对于C组，LPS组p65含量显著增加（P＜0.01）；加入丙泊酚的 P1、P2、P3组较 LPS组均显著减少 （P＜0.05、0.01），并呈现剂量依赖性。见表2。

表2 丙泊酚对中性粒细胞核内p65蛋白含量的影响（x±s，n=20）

3 讨论

丙泊酚是临床常用的全身麻醉药，研究发现其还具有抗炎作用[2]。笔者前期在体研究也发现丙泊酚可以通过抑制大鼠中性粒细胞NK-κB亚基p65的激活，减轻内毒素休克大鼠炎症反应[3]。对人体中性粒细胞是否也有同样的作用，目前尚少见报道。

本研究采用人体PMN离体培养，一方面排除在体研究过程中机体各系统之间相互作用产生的干扰因素；另一方面，前期研究均采用的动物实验，本研究应用人体PMN进行进一步研究。丙泊酚抗炎的最重要环节是减少炎性细胞因子的释放，因此检测PMN培养液中炎性细胞因子的浓度，可以反映抗炎效果。TNF-α、IL-8是最常见的炎性细胞因子，因此本研究选择了对培养液中TNF-α、IL-8浓度进行了检测。结果显示，LPS组比对照组上清液中TNF-α、IL-8均增加了2.5倍以上，而加入丙泊酚的P1、P2、P3组TNF-α、IL-8均出现了显著下降，且具有剂量依赖性。剂量达到8μg/mL时效果最好，但仍显著高于对照组（P＜0.05），也提示丙泊酚可能并不能完全抑制LPS引起的PMN释放炎性细胞因子的增加。有研究显示，巨噬细胞丙泊酚抗炎的重要靶细胞[2]。

NK-κB作用广泛，参与炎性细胞因子的转录只是其作用之一[4]。NK-κB由p65/p50二聚体组成，正常状态下和其抑制蛋白共同存在于胞质内。在机体受到特定刺激后，p65蛋白和p50迅速解离，跨过细胞核膜进入核内，进而启动下游炎性细胞因子转录，释放炎性细胞因子。因此p65蛋白进入核内是炎性细胞因子转录的关键环节，检测核内p65的含量可以代表NK-κB激活水平。结果显示，LPS组核内p65显著增加，加入不同浓度的丙泊酚组p65含量均出现了不同浓度的下降。这也与笔者对细胞因子浓度的检测结果相一致。提示丙泊酚是通过抑制p65的激活减轻了炎性细胞因子的释放。过量炎性细胞因子释放是急性肺损伤（ALI）发病的重要机制，因此丙泊酚可以减少炎性细胞因子释放，减轻ALI，这也在本课题前期动物实验中得到证实[1]。

综上所述，本实验条件下证实，丙泊酚可以通过抑制p65蛋白的激活降低LPS激活人体PMN后释放炎性细胞因子浓度。丙泊酚的这种抑制作用具有剂量依赖性。

[1]李莎，张焰，彭生.异丙酚对内毒素性急性肺损伤大鼠中性粒细胞NF-κB 活化的影响[J].中华麻醉学杂志，2010，30（7）：862-864.

[2]Hsing CH，Lin MC，Choi PC，et al.（2011）Anesthetic Propofol Reduces Endotoxic Inflammation by Inhibiting Reactive Oxygen Species-regulated Akt/IKKβ/NF-κB Signaling[J].PLoSONE，6（3）：17598.

[3]李莎，张焰，彭生.异丙酚对急性肺损伤大鼠肺组织凋亡及NF-κB p65 的影响[J].中华急诊医学杂志，2011，20（5）：494-497.

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[5]Adrie C，Pinsky MR.The inflammatory balance in human sepsis[J].Intensive Care Medicine，2000，26（4）：364-375.