绿茶胶囊对黑巧克力中表儿茶素和儿茶素在人体内生物利用率的影响

蒋 晗，Andrea Day

（1中国计量学院 生命科学学院，浙江，杭州 3100182 英国利兹大学 食品科学与营养学院，英国，利兹 LS29JT）

表儿茶素和儿茶素是黄烷醇类化合物的两个单体，是广泛存在于蔬菜水果、茶叶和红酒中的多酚类抗氧化物质，对阻止动脉粥样硬化的形成、预防脂质过氧化以及抵抗癌症和心血管疾病均有一定作用.黄烷醇类化合物主要以苷元的形式存在，在胃酸中相对稳定，但当其消化后转移到小肠和肝脏中时，会很快发生硫酸化、糖基化和甲基化等代谢反应.此外，大多数没有被小肠吸收的黄烷醇类化合物都被大肠杆菌代谢成了酚酸和戊内酯的衍生物后被吸收［1－6］.黄烷醇类化合物的吸收通常都很快，一般0.5～4h便达到吸收高峰，其代谢产物可以很快分泌到尿液和胆汁中［7］.根据Wang等人的实验证实，在摄入富含黄烷醇类化合物的食物后，血液中黄烷醇类化合物的浓度在1～2.5h内达到高峰［8］，同时Schramm等人进一步证实，在这之后，血液中黄烷醇类化合物的浓度不断下降直至8h左右几乎不能测得［9］.

巧克力中尤其是黑巧克力富含黄烷醇，其中最多的是表儿茶素，其次是儿茶素.荷兰科学家研究发现，人体摄入的儿茶素含量几乎有20%来自巧克力［10］.而茶叶中也富含表儿茶素和儿茶素.Henning等人认为茶提取物营养片剂既保留了绿茶和红茶中的有益物质，同时又去除了茶叶中的咖啡因等副作用成分［11］.

目前，很多研究都致力于巧克力中多酚类物质在人体内的生物利用率［3，12］或者茶叶、茶提取物营养片剂中的多酚成分在人体内的生物利用率［13－14］，并且有研究发现不同的食物组合可能会影响多酚类化合物在人体内的吸收和分泌.但其中也不乏争议性结论，例如Serafini等人认为牛奶蛋白质对儿茶素的吸收有抑制作用［15］.而Hollman和Reddy等人则研究发现牛奶的摄入对黄酮类化合物的吸收几乎没有影响［1，16］.至今还没有茶提取物营养片剂对黑巧克力中的黄烷醇类化合物在人体中吸收利用率的影响的相关报道.本文以志愿者尿液为分析样本，以高效液相色谱（HPLC）为主要分析手段，针对绿茶胶囊对黑巧克力中表儿茶素和儿茶素在人体中的吸收利用率所造成的影响展开研究.

1 材料与方法

1.1 材料

Thorntons牌抗氧化浆果黑巧克力（Thorntons Antioxi Choc Berry Boost，批号：L3031），内含蓝莓和树莓提取物，购买于英国.绿茶胶囊购买自英国Healthspan，Guernsey公司.

1.2 试验仪器与试剂

高效液相色谱仪（美国安捷伦公司，型号Agilent 1200，配紫外检测器），冷冻微量离心机（美国Thermo Electron Corporation公司，型号IEC MicroCL 17），离心浓缩蒸发仪（英国Genevac公司，型号EZ－2），电子分析天平（瑞士 Mettler公司，型号 AT－261），涡旋振荡器（美国 Scientific Industries公司，型号Vortex Genie 2），冷冻型台式大容量高速离心机（德国Eppendorf公司，型号：Centrifuge 5810R），线性振荡水浴（英 国Grant仪器（剑桥）有限公司，型号：Aqua 12plus，超声波清洗器（英国Clifton公司，型号DU－8）.

甲醇、正己烷、乙酸乙酯、乙腈、三氟乙酸均为色谱纯，购自Fisher Scientific公司.醋酸、四氢呋喃、叠氮化钠为色谱纯，购自Sigma－Aldrich公司.丙酮为色谱纯，购自Alfa Aesar公司.β－葡萄糖醛酸苷酶Ⅱ提取自罗马蜗牛（Helix pomatia，粗提取溶液：116712U／mL）为分析纯，（－）－表儿茶素为分析纯，均购自Sigma－Aldrich公司.（－）－儿茶素购自Extrasynthèse公司.L－抗坏血酸购自Calibio Chem公司.所有试验用水均为超纯水.

1.3 试验方法

1.3.1 黑巧克力中（－）－儿茶素和（－）－表儿茶素的提取

黑巧克力中（－）－儿茶素和（－）－表儿茶素的提取采用Langer的方法［17］.

1.3.2 绿茶胶囊中（－）－儿茶素和（－）－表儿茶素的含量测定

取一颗绿茶胶囊，研磨成粉末之后精确称量.用10mL 25%甲醇溶液（内含0.1%抗坏血酸）提取黄酮类化合物，在60℃下水浴15min，超声5min后冷却，在35℃下，以3500r／min离心8min，取上清液.再用25%甲醇重复提取两次，混合三次提取的上清液（约30mL），取1mL过0.45μm PTFE滤膜，得到HPLC样品溶液.

1.3.3 给食材及尿样采集

本试验经英国利兹大学伦理委员会批准.6名健康受试者（5男1女），年龄（平均值±方差）为（23.7±1.2）岁，身体质量指数（BMI，单位kg／m2）在19.5～26.6之间，饮食习惯稳定并且无素食主义者，无过敏史，无新陈代谢或肠胃方面的疾病，试验期间无服用影响代谢的药物，在签署知情同意书并体检合格后纳入试验.受试者随机分为两组，受试者在试验前一天按照所发放的低黄酮类食物清单进食，于晚8点后禁食12h后（饮用水除外）：第一组受试者于次日晨空腹摄入50g黑巧克力（内含152mg表儿茶素和33mg儿茶素），第二组受试者在同一时间空腹摄入50g黑巧克力后立即服用一颗绿茶胶囊（绿茶胶囊含表儿茶素207mg，儿茶素39mg）.在摄入食物前（0h）和摄入食物后（0～1.5，1.5～3，3～5h），总共四个时间段分别收集尿液，分装在四个容器中（每个容器内含0.5g抗坏血酸）.受试者在此期间不得服用除饮用水（每1.5h必须摄入至少200mL饮用水）以外的任何食物.1周后交叉摄入食物，方法和时间点均同前一周期.每位受试者每个时间段的总尿液排放量将被统计.收集到的尿液立即按时间段被分装入50mL Falcon试管中，每个试管内加入0.5mL 10%叠氮化钠，离心（10min，3000r／min，4℃），去除不可溶物质和一些细胞碎片，取上清液于－20℃保存至测定.

1.3.4 尿液样本处理

参照Ito方法［18］，尿液样本用自来水解冻后，取1mL转移至1.5mL微量离心管中，加入0.11mL，1mol／L pH 5.0醋酸－醋酸钠缓冲液（含1%抗坏血酸）酸化尿液样本，加入13000U β－葡萄糖醛酸苷酶，在37℃下水浴酶解1h.酶解后，用400μL乙酸乙酯提取尿液中被水解的糖苷配基，涡旋混匀2min，5000r／min离心10min，取上清液.再重复提取两次.将三次收集到的上清液（约1.05mL）在离心浓缩蒸发仪中30℃下干燥1h.用200μL，25%甲醇溶液（含1%抗坏血酸）重溶干燥物质，涡旋混匀2min，取1mL通过0.2μmPTFE滤膜制成HPLC样品溶液.

1.3.5 （－）－表儿茶素和（－）－儿茶素测定液相色谱工作条件

黑巧克力的正相HPLC分析条件［17］：

色谱柱：Phenomenex DevelosilTM二醇基色谱柱（250mm×4.6mm，5μm，100Å），柱温：35℃，预柱：Phenomenex Security Guard cartridgeTM氰基柱（4×3.0mm），流动相：A 为乙腈∶醋酸（ACN∶HOAc，98∶2；v∶v），B为甲醇∶水∶醋酸溶液（CH3OH∶H2O∶HOAc，95∶3∶2；v∶v∶v），梯度程序：0～3min，7%B；3～57min，7%B→37.6%B；57～60min，37.6%B→100%B；60～67min，100%B→100%B；67～73min，100%B→7%B；73～83min，7%B→7%B.流速：0.6mL／min；检测器和检测波长：荧光检测器，激发波长：230nm，发射波长：321nm；进样量：5μL.

绿茶胶囊和尿液样本的反相HPLC分析条件：

色 谱 柱：Waters C18XbridgeTMcolumn（100mm×2.1mm，3.5μm），柱温：35℃，流动相：A为水：四氢呋喃（THF）∶三氟乙酸（TFA）（H2O∶THF∶TFA，98∶2∶0.1%；v∶v∶v），B为乙腈（ACN）：三氟乙酸（TFA）（ACN∶TFA，99.9∶0.1；v∶v），梯度程序：0min：7%B；0～3.2min，7%→13%B；3.2～7.6min，13%B→15%B；7.6～9.8min，15%B→100%B；9.8～13.6min，100%B→100%B；13.6～15.6min，100%B→7%B；15.6～20.6min，7%B→7%B.流速：0.4mL／min；检测器和检测波长：荧光检测器，激发波长：230nm，发射波长：321nm；进样量：10μL.

1.3.6 标准曲线的制备

巧克力标准曲线：

用萃取剂（丙酮∶水∶醋酸：70∶28∶2）将（－）－表儿茶素标准品粉末和（－）－儿茶素标准品粉末各自配制成2mmol／L标准品溶液.将此标准品溶液用80%的甲醇溶液稀释，得到0，0.1，1，10，100，500μmol／L标准溶液，通过0.2μm PTFE滤膜制成HPLC样品溶液.按照1.3.5中黑巧克力的HPLC分析方法检测，以浓度为横坐标（μmol／L），以峰面积为纵坐标制备标准曲线.

绿茶胶囊和尿液样本的标准曲线：

用80%甲醇溶液将（－）－表儿茶素标准品粉末和（－）－儿茶素标准品粉末各自配制成2mmol／L标准品溶液.将此标准品溶液用80%甲醇溶液稀释，得到0，0.1，1，10，100，500μmol／L标准溶液，通过0.2μm PTFE滤膜制成 HPLC样品溶液.按照1.3.5中绿茶胶囊和尿液样本的HPLC分析方法检测，以添加浓度为横坐标（μmol／L），以峰面积为纵坐标制备标准曲线.

1.3.7 方法回收率试验

用25%甲醇溶液（含0.1%抗坏血酸）配制10mmol／L（－）－表儿茶素标准液.用此标准液将1mL任意志愿者尿液空白样本（0h）配制成含（－ ）－表儿茶素浓度分别为0，10，100 和500μmol／L的尿液样品.按照1.3.4方法处理尿液样本，按照1.3.5中绿茶胶囊和尿液样本的反相HPLC分析方法检验（－）－表儿茶素在尿液样本中的回收率.测得（－）－表儿茶素的回收率在（89.9±4.5）%（n＝3）.

2 结 果

2.1 表儿茶素和儿茶素HPLC测定方法的标准曲线、线性范围及检出限

（－）－表儿茶素和（－）－儿茶素在黑巧克力、绿茶胶囊和尿液样本中HPLC测定方法的标准曲线和相关系数表见表1.（－）－表儿茶素和（－）－儿茶素在0.1～500μmol／L浓度范围内线性关系良好，相关系数均在0.999以上.（－）－表儿茶素的检出限是0.06μmol／L（S／N≥3），定量限为0.20μmol／L（S／N≥10）.（－）－儿茶素的检出限是0.03μmol／L（S／N≥3），定量限为0.11μmol／L（S／N≥10）.可以满足本实验的样品中这两种黄烷醇类物质的分析.

表1 （一）－表儿茶素和（一）－儿茶素的标准曲线Table 1 Standard curve of（一）－epicatechin and（一）－catechin

2.2 黑巧克力和绿茶胶囊中（一）－表儿茶素和（一）－儿茶素的含量

通过HPLC外标法可知，在黑巧克力的HPLC分析方法中，（－）－表儿茶素的保留时间约为8.7min，（－）－儿茶素的保留时间约为8.9min.通过表1中的标准曲线，可计算得黑巧克力中的（－）－表儿茶素为（303±25）mg／100g（平均值±SD；n＝3），（－）－儿茶素的含量为（66±7）mg／100g（平均值±SD；n＝3）.

同理，在绿茶胶囊的HPLC分析方法中，（－）－表儿茶素的保留时间约为3.2min，（－）－儿茶素的保留时间约为2.0min.通过表1中的标准曲线，可计算得绿茶胶囊中的（－）－表儿茶素为（207±8）mg／100g（平均值±SD；n＝3），（－）－儿茶素的含量为（39±2）mg／100g（平均值±SD；n＝3）.

2.3 表儿茶素、儿茶素和它们的代谢产物在尿液样本中的定性鉴别

根据各标准品在相同HPLC条件下的多次实验保留时间记录，自由态儿茶素在尿液样本中的保留时间约为2.0min，自由态表儿茶素约为3.1min，3′－甲基儿茶素约为4.3min，3′－甲基表儿茶素约为5.9min，4′－甲基表儿茶素约为7.1min.在本次试验所收集的尿液样本中，未发现磷酸化的表儿茶素和儿茶素.图1为任意志愿者在两试验阶段中随机抽取某一时间段（1.5～3h）尿样的HPLC分析图谱.

图1 尿样中表儿茶素、儿茶素和它们的甲基化形态的HPLC图谱Figure 2 HPLC chromatogram of free epicatechin，catechin and their methylated forms in the urine samples

2.4 表儿茶素、儿茶素和它们的代谢产物在尿液样本中的定量分析

通过表1中尿液样本的标准曲线的和HPLC对尿液样本的分析，可以计算出6名志愿者在两个试验阶段（第一阶段：巧克力；第二阶段：巧克力＋绿茶胶囊）所收集的尿液样本中，表儿茶素、儿茶素和它们的代谢产物分别在三个试验时间段（0～1.5h，1.5～3h，3～5h）的含量，结果如表2所示.

表2 表儿茶素、儿茶素和它们的代谢产物在尿液中的含量＊Table 2 Quantities of epicatechin，catechin and their metabolites in the urine samples＊ μg

除了第一阶段中的3′－甲基儿茶素在第二时间段（1.5～3h）的尿液样本中才被检测出，其余尿液分泌的表儿茶素、儿茶素以及它们的代谢产物均在第一时间段（0～1.5h）检出.实验发现，虽然第二阶段（巧克力＋绿茶胶囊）所摄入的表儿茶素和儿茶素含量均比第一阶段（巧克力）多，但第一阶段尿液分泌的表儿茶素、儿茶素以及它们的代谢产物含量均高于第二阶段.除此之外，经过β－葡萄糖醛酸苷酶的酶解，大部分糖基化的表儿茶素和儿茶素成为自由形态.甲基化的代谢产物中3′－甲基表儿茶素含量较高，3′－甲基儿茶素含量很低.未发现任何磷酸化代谢产物.

实验也分析了六位志愿者在不同阶段的尿样中表儿茶素和儿茶素的含量（以表儿茶素或儿茶素的自由形态和它的甲基化形态的总量计），如图2和图3.从图2和图3可知，6位志愿者的尿液空白样本（0h）中均无表儿茶素或儿茶素成分，且每个阶段志愿者间的个体吸收差异较大（p＜0.05）.在6位志愿者中，表儿茶素和儿茶素在尿液分泌中的最高含量均出现在第三时间段（3～5h），这说明可能在5h内，两者在尿液中的分泌过程仍未完全结束.

图2 6位志愿者分别在第一阶段和第二阶段的不同时间段尿样中表儿茶素的含量Figure 3 Urinary total epicatechin of 3time periods for all 6subjects during phase 1and phase 2study

图3 6位志愿者分别在第一阶段和第二阶段的不同时间段尿样中儿茶素的含量Figure 4 Urinary total catechin of 3time periods for all 6subjects during phase 1and phase 2study

2.5 表儿茶素和儿茶素在人体中的生物利用率

按如下公式计算表儿茶素或儿茶素在人体内的生物利用率：

六名志愿者在不同阶段中表儿茶素和儿茶素的生物利用率如表3所示.由表3可知，尽管第二阶段摄入的表儿茶素和儿茶素总量高于第一阶段，但第一阶段的表儿茶素和儿茶素在尿液中的回收率均大于第二阶段.另外，表儿茶素在两个试验阶段中的生物利用率均大于儿茶素（除了1号志愿者在第二阶段试验中，儿茶素和表儿茶素生物利用率相等）.

表3 两个阶段中表儿茶素和儿茶素在尿样中的回收率Table 3 Excretion recovery of EC and C in urine after chocolate intake with （phase 2）or without（phase 1）agreen tea capsule

3 讨 论

本实验研究了绿茶胶囊对黑巧克力中表儿茶素和儿茶素在人体内生物利用率的影响.实验结果表明，同时摄入黑巧克力和绿茶胶囊与单独摄入黑巧克力相比，可能会导致人体对表儿茶素和儿茶素的生物利用率降低或者吸收时间的推迟.原因可能是绿茶胶囊中的某些成分和巧克力中的成分相互作用，阻止或延迟了表儿茶素和儿茶素的吸收.Silberberg等人曾在动物实验中发现，槲皮黄酮和儿茶素在消化水平上存在竞争，导致槲皮黄酮在肠内的吸收减少并可能导致儿茶素吸收的延迟［19］.这个情况和本次试验第二阶段较类似，但其为动物性试验，摄入的多酚类化合物含量也比较高.确切原因需进一步实验分析.

另外，虽然表儿茶素和儿茶素很快能经尿液分泌，但从本次结果看出，两者5h内在尿液中的分泌过程并未完全结束.今后试验可考虑将时间延长至8h，但这对志愿者的耐饿能力要求较高.

其次，本次试验所采用的HPLC分析方法不能够鉴别（＋）－儿茶素和（－）－儿茶素等旋光异构体.除此之外，有一些没有经尿液分泌的表儿茶素和儿茶素被肠道微生物降解成了小分子的酚酸，本次试验无法检测到.这两个原因可能会导致表儿茶素和儿茶素的生物利用率被低估.

Cao等人发现在相同条件下同时测定大豆异黄酮在体内的浓度，该成分在血浆中的浓度有时并不能和尿液中的浓度很好地吻合［20］.所以进一步的试验需结合测定血浆样品中儿茶素和表儿茶素及其代谢产物的浓度，以更好地确认试验结果.

［1］HOLLMAN P C H，VAN HETHOF K H，TIJBURG L B，et al.Addition of milk does not affect the absorption of flavonols from tea in man［J］.Free Redical Research，2001，34：297－300.

［2］王雪飞，张 华.多酚类物质生理功能的研究进展［J］.食品研究与开发，2012，33（2）：211－214.

［3］BABA S，OSAKABE N，YASUDA A，et al.Bioavailability of（－）－epicatechin upon intake of chocolate and cocoa in human volunteers［J］.Free Redical Research，2000，33：635－641.

［4］HACKMAN R M，POLAGRUTO J A，ZHU Q Y，et al.Flavanols：digestion，absorption and bioactivity［J］.Phytochemistry Reviews，2008，7：195－208.

［5］郭长江，韦京豫.食物多酚类物质的种类、膳食摄入量与生物利用率［J］.营养健康新观察，2003，2：28－34.

［6］SPENCER J P，ABD－EL－MOHSEN M M，RICE－EVANS C.Cellular uptake and metabolism of flavonoids and their metabolites：implications for their bioactivity［J］.Archives Biochemistry Biophysics，2004，423：148－161.

［7］HOLLMAN P C H，ARTS L C W.Review flavonols，flavones and flavanols–nature，occurrence and dietary burden［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2000，80：1081－1093.

［8］WANG J F，SCHRAMM D D，HOLT R R，et al.A doseresponse effect from chocolate consumption on plasma epicatechin and oxidative damage［J］.Journal of Nutrition，2000，130：2115S－2119S.

［9］SCHRAMM D D，KARIM M，SCHRADER H R，et al.Food effects on the absorption and pharmacokinetics of cocoa flavanols［J］.Life Sciences，2003，73：857－869.

［10］ARTS C W，HOLLMAN P C H，KROMHOUT D.Chocolate as a source of tea flavonoids［J］.The Lancet，1999，354：488.

［11］HENNING S M，NIU Y，LEE N H，et al.Bioavailability and antioxidant activity of tea flavanols after consumption of green tea，black tea，or a green tea extract supplement［J］.The American Journal of Clinical Nutrition，2004，80：1558－1564.

［12］DONOVAN J，CRESPY V，OLIVEIRA M，et al.（＋）－Catechin is more bioavailable than （－ ）－catechin：relevance to the bioavailability of catechin from cocoa ［J］.Free Redical Research，2006，40：1029－1034.

［13］ROOWI S，STALMACH A，MULLEN W，et al.Green tea flavan－3－ols：colonic degradation and urinary excretion of catabolites by humans［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2010，58：1296－1304.

［14］HENNING S M，NIU Y，LEE N H，et al.Bioavailability and antioxidant activity of tea flavanols after consumption of green tea，black tea，or a green tea extract supplement［J］.The American Journal of Clinical Nutrition，2004，80：1558－1564.

［15］SERAFINI M，GHISELLI A，FERRO－LUZZ A.In vivo antioxidant effect of green and black tea in man［J］.European Journal of Clinical Nutrition，1996，50：28－32.

［16］REDDY V C，SAGAR G W，SREERAMULU G，et al.Addition of milk does not alter the antioxidant activity of black tea［J］.Annals of Nutrition and Metabolism，2005，49：189－195.

［17］LANGER S，MARSHALL L J，DAY A J，et al.Flavanols and methylxanthines in commercially available dark chocolate：a study of the correlation with nonfat cocoa solids［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59：8435－8441.

［18］ITO H，GONTHIER M P，MANACH C，et al.Polyphenol levels in human urine after intake of six different polyphenol－rich beverages ［J］.British Journal of Nutrition，2005，94：500－509.

［19］SCALBERT A，MORAND C，MANACH C，et al.Absorption and metabolism of polyphenol in the gut and impact on health ［J］.Biomedicine ＆ Pharmacotherapy，2002，56：276－282.

［20］CAO Y，ALAFAT A M，DOERGE D R，et al.Isoflavones in urine，saliva，and blood of infants：data from a pilot study on the estrogenic activity of soy formula［J］.Journal of Exposure Science ＆Environmental Epidemiology，2009，19：223－234.