蜜蜂囊状幼虫病病毒的基因型分析＊

曹 兰，沈克飞，张邑帆，罗文华，王瑞生，任 勤，郭 军，王志冬，戴荣国＊

（1.重庆市畜牧科学院，重庆荣昌 402460；2.吉林省舒化市上营农业技术推广站，吉林舒化 132607）

蜜蜂囊状幼虫病（Sacbrood）是由囊状幼虫病病毒（Sacbrood virus，SBV）感染引起的传染病。该病最早于1913年发现于西方蜜蜂（Apismellifera），1971年中国广东暴发中蜂囊状幼虫病，1981年从泰国的印度蜜蜂体内分离到SBV。在流行的早期，囊状幼虫病对蜂群损害较大，之后蜂群会产生一定的抵抗性，蜂群发病率降低。现在一般认为该病不是西蜂的主要疾病。然而，囊状幼虫病对东方蜜蜂（Apiscerana）的危害仍十分严重，是侵害幼虫的主要传染病。中蜂（Apisceranacerana）蜂群囊状幼虫病的发病率仍在50%～70%。

已有的研究表明，分离自不同蜜蜂种类和地理种群蜜蜂宿主的囊状幼虫病病毒的基因组序列存在差异。Grabensteiner E等［1］依据扩增自6个国家16份西蜂样本的占基因组37.7%的不同区域的5个片段序列，对SBV进行系统进化分析，一致性地得出至少可将其分成欧洲型、远东型和南非型3个基因型。中蜂患囊状幼虫病习惯上称为中蜂囊状幼虫病，其病原称为中蜂囊状幼虫病病毒（Chinese sacbrood virus，CSBV）。早期研究指出，CSBV 和SBV除了在生理和生化特性上相似外［2］，在蛋白质组分［3］、抗原性上有所不同，且不发生交叉感染［4］。对流行于国内的CSBV基因组序列的分析发现，不同地区CSBV 分离株存在序列差异［5－12］。那么，分离自不同蜜蜂种类和地理种群蜜蜂宿主的囊状幼虫病病毒的基因型关系如何？Grabensteiner E等［1］认为SB14f／SB15r所扩增序列更适合于该病毒的遗传多样性分析。本文利用SB14f／SB15r所扩增的SBV RNA依赖的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp）基因片段序列，基于系统进化角度分析囊状幼虫病病毒的基因型关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本 采自重庆地区中蜂场具有典型囊状幼虫病特征的死幼虫，样本于－20℃保存。

1.1.2 序列 应用RT－PCR扩增自所采集的样本，或下载自GenBank登录的SBV序列，具体参见表1。

1.1.3 试剂 rTaqDNA聚合酶、dNTP及pMD18－T、Trizol、AMV Reverse Transcriptase、RNase inhibitor为宝生物工程（大连）有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 RNA 的提取 取样本浸出液50μL～100μL加Trizol至1mL，混匀后室温静置15min，加入250μL氯仿充分振荡后静置15min，在4℃以12 000r／min离心15min。取上清加入等体积异丙醇，混匀，在－20℃下静置1h，在4℃以12 000r／min离心10min。沉淀以700mL／L乙醇洗1次，吸干上清，沉淀溶解于100μL经DEPC处理的去离子水中，以备反转录。

1.2.2 RT－PCR 反转录反应体系：25μL体系中含有5× buffer 5μL，2.5mmol／L dNTPs 2μL，10μmol／L引物SB15r1μL，RNA 溶液15.5μL，40U／μL AMV Reverse Transcriptase 0.5 μL，10U／μL RNase Inhibitor 1μL。混合均匀，42℃水浴孵育1h合成cDNA，98℃灭活3min，置－20℃保存。

PCR反应体系：10×PCR buffer（含15mmol／L Mg2＋）2.5μL，2.5mmol／L dNTPs 0.5μL，5U／μL rTaq0.10μL，10μmol／L 引 物SB14f和SB15r0.5μL，cDNA 0.5μL，用去离子水补足25μL。PCR反应参数：94℃2min；94℃30s，50℃30s，72℃ 45s，共进行30循环；72 ℃5min；4℃终止反应。

表1 参与分析的SBV序列Table 1Sequences of SBV used

1.2.3 条带分析及序列测定 PCR产物在Gold View染色下经10g／L琼脂糖凝胶电泳。回收PCR目的 条 带，将 片 段 克 隆 进 pMD18－T 载 体，用pMD18－T质粒上的通用引物M13进行序列测定，将序列在NCBI上作BLAST搜索以进行同源性分析。

1.2.4 序列分析 应用ClustalW2（http：／／www.ebi.ac.uk／Tools／msa／clustalw2／＃）进行多序列比对分析。使用MEGA 4软件的Bootstrap Test of Phylogeny，基于邻接法的p－distance方法建立进化树，以进行基因型分析。

2 结果

2.1 RT－PCR产物

使用SB14f／SB15r引物对运用RT－PCR方法，从具有囊状幼虫病典型特征的病死中蜂幼虫体中扩增到与预期579bp大小一致的条带（图1）。经序列测定及序列分析得出，所扩增片段序列与CSBV序列同源性高于95%，与SBV同源性高于89%，与其他病原核酸序列无同源性，表明扩增所得序列是SBV序列。

图1 中蜂病死幼虫的囊状幼虫病病毒的RT－PCR扩增结果Fig.1 Profile of RT－PCR for SBV from dead Chinese bee larvae

2.2 基因型分析

利用SB14f／SB15r引物对共扩增到3条具有明显变异特征的CSBV基因片段。在GenBank中下载40条包含SB14f／SB15r引物对应区域的序列，其中有感染韩国东方蜜蜂SBV的17个序列，感染德国西蜂SBV的8个序列，使用多种构建进化树的方法得到与图2类似的基因型分化结果。本结果删去了相似性较高的感染韩国东方蜜蜂的SBV其他16个序列及感染德国西蜂的SBV其他4个序列，是选择代表性序列所得到的基因型分化图。从已有的序列来看，目前SBV可分为3个基因型，即远东型、欧洲型和南非型。在远东基因型内，存在东方蜜蜂和西蜂2个亚型，在东方蜜蜂型内感染在中国和韩国境内饲养的东方蜜蜂的SBV分属不同的进化群。欧洲基因型内存在中欧和英国2个亚型。由此可见，SBV流行株总体上按地域隔离进化，但也有例外，如德国和尼泊尔境内的西蜂群存在远东型和欧洲型2个基因型，感染中蜂的CSBV辽宁株属于西蜂亚型（图2）。

图2 SBV基因型分析Fig.2 Genotyping of Sacbrood virus

3 讨论

依据SB14f／SB15r所对应的囊状幼虫病病毒基因组序列，可将感染西蜂和东方蜜蜂的SBV基因型分为欧洲型、远东型和南非型3个基因型，总体上按地域分型。在远东型毒株内存在东方蜜蜂亚型和西蜂亚型2个亚型毒株，这可能是病毒为适应当地蜜蜂宿主作出的适应性进化［1］，也可能是病毒按地域隔离进化的结果，进一步验证需要分析感染当地饲养的东方蜜蜂和西蜂囊状幼虫病病毒的遗传学特性。在尼泊尔和德国境内饲养的西蜂群存在欧洲型和远东型2个基因型毒株，以及中国中蜂群存在东方蜜蜂亚型和西蜂亚型2个亚型毒株，这可能是SBV在基因型和基因亚型分化过程中保留下来的原型，暗示SBV的变异路径。

西蜂和中蜂在生物学上存在很多差异，如中蜂可以自己清除自身的蜂螨，对蜂螨有一定抵抗性，而西蜂对蜂螨易感。蜂螨感染诱导西蜂和中蜂在涉及代谢过程和神经信号传导方面基因的差异表达［12］，提供了蜂螨感染两者的分子应答信息，阐明了对蜂螨耐受性的分子机制。张国只［13］研究发现，营养杂交改变了中蜂和意蜂3日龄幼虫的蛋白质表达谱，两者的差异蛋白不同，CSBV感染改变了营养交换了的中蜂和意蜂3日龄幼虫的表达谱，两者的差异蛋白也不同。由此推测，SBV感染在东方蜜蜂和西蜂所表现出的临床症状严重程度可能更多地与宿主有关。

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