银杏叶提取物对缺氧状态下牛视网膜血管内皮细胞增殖的影响

吴宁玲 吴沂旎 庄曾渊 郭晓勤

近年来研究发现血管内皮细胞是重要的内分泌细胞，可分泌多种活性物质参与血管舒展和紧缩调节的体液调节机制。视网膜血管内皮细胞（retina vascular endothelial cells，RVECs）为血－视网膜屏障的内屏障，RVECs损伤会导致血－视网膜屏障受损及血管舒展和紧缩调节的活性物质分泌紊乱，加快许多眼部疾病（如糖尿病性视网膜病变、黄斑变性、高度近视等）的发展，因此研究保护RVECs是防治这类疾病的新途径。

银杏叶，又名白果树叶，为银杏科植物银杏树的干燥叶。《本草纲目》记载其性味甘苦而涩，入肺、肾经。它有定喘、止咳、止带浊、缩小便等作用。银杏叶提取物（extract of ginkgo biloba，EGB）是采用现代提取技术从银杏叶中提取的活性物质，其有效成分主要是黄酮甙类和萜内酯类化合物。银杏叶提取物具有改善血液流变学状况、抑制血小板聚集、抗氧化、清除自由基、缓解缺血缺氧及舒张血管平滑肌等有益作用。本文就EGB对缺氧状态下RVECs增殖的影响进行了系统研究。

1 材料与方法

1.1 材料

（1）牛视网膜血管内皮细胞（购自北京中日友好医院临床研究所）。（2）试剂和仪器：DMEM高糖培养基和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），美国 Gibco公司产品；胰酶、甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亚枫，美国 Sigma 公司产品；内皮细胞生长因子（endothelial cell growth factor，ECGF），购自北京中日友好医院临床研究所；银杏叶提取物标准品（中国药品生物制品产检定所产品，批号：110866-200803）。 ELX808 酶标仪，美国 Bio-Tek公司产品；倒置显微镜，日本Olympus公司产品。

1.2 牛视网膜血管内皮细胞培养

将购买的牛视网膜血管内皮细胞复苏，用含200 g/L FBS、100 mg/L ECGF、100mg/L 肝素以及 100×103U·L-1双抗的DMEM完全培养基接种于20g·L-1明胶包被的培养瓶，置37℃、体积分数5%CO2孵箱培养。以后每4~5 d换液1次直至长成单层细胞。选第7代内皮细胞，0.1%胰蛋白酶消化备用。

1.3 实验分组

实验分为5组，即（1）空白对照组：无血清、无生长因子的DMEM培养液；（2）缺氧组：细胞对照组＋终浓度 1 mmol/ml CoCl2；（3）EGB 低浓度组：缺氧组＋0.001 μg/ml银杏叶提取物；（4）EGB 中浓度组：缺氧组＋0.01 μg/ml银杏叶提取物；（5）EGB 高浓度组：缺氧组＋0.1 μg/ml银杏叶提取物。

1.4 MTT比色实验检测RVECs增殖情况

将血管内皮细胞以3×104个/ml浓度接种于96孔培养板中，每孔200 μl，每组设5个复孔，用含20%胎牛血清及100 μg/ml生长因子的培养基在37℃、5%CO2条件下培养24 h，根据上述实验分组将CoCl2和含不同浓度EGB的培养基分别与RVECs继续培养24 h及 48 h后，96孔板每孔加入20 μl MTT（5 mg/ml），继续孵育 4 h，终止培养，小心吸弃孔内上清培养液，每孔再加入150 μl DMSO，打匀振荡5 min，使结晶物充分溶解。选择492 nm波长，在酶标仪上测定各孔光密度值。

1.5 统计学方法

采用统计软件包SPSS for Windows（17.0版）统计软件对计量资料进行方差分析，用Least-significant-difference（LSD）法进行两两比较。

2 结果

2.1 细胞形态学观察

倒置显微镜下观察血管内皮细胞形态，内皮细胞复苏后培养24 h，可见约30%～40%RVECs已贴壁，呈三角形或短梭形，排列不规则，核淡，胞膜明显（图 1），3～4 d后成片融合，细胞紧密排列，互不重叠，呈典型的铺路卵石样结构。传代细胞约4～5 d能铺满培养瓶底。缺氧组的细胞贴壁率明显减少，呈凋亡细胞形态学改变（图2）。EGB组细胞贴壁率增加，凋亡细胞减少（图3）。

2.2 不同浓度银杏叶提取物对缺氧状态下RVECs增殖的影响

EGB低、中、高浓度组各时间点的光密度值均高于缺氧组（P<0.05）。分组培养24 h，EGB高浓度组（0.1 μg/ml）的增殖活性最高；培养 48 h，EGB 中浓度组（0.01 μg/ml）的增殖活性最高，EGB 高浓度组的细胞增殖减缓（表1）。

3 讨论

MTT可以将活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为难溶性的蓝紫色结晶物，使沉积在细胞中，通过使用DMSO溶解细胞中的蓝紫色结晶物，并用自动酶标仪在492 nm波长处测定其吸光度值，即可间接反应活细胞数量。本实验以体外培养牛视网膜血管内皮细胞为观察对象，以MTT法检测RVECs在不同浓度银杏叶提取物作用下的增殖活性。

实验性缺氧方法有2种，一种是在低氧环境中培养实验细胞或组织，也称为环境缺氧；另一种是在细胞或组织培养液中加入铁的螯合剂或CoCl2，阻断氧信号的转导，在细胞中模拟低氧信号转导，也称为细胞缺氧。环境缺氧方法由于需要特殊的培养设备和低氧浓度的混合气体，限制了其在实验中的应用。Co2+是铁螯合酶的底物，可以取代血红蛋白卟啉环中的Fe2+，但是Co2+对氧的亲和力较低，使血红蛋白不能与氧结合，而保持还原构象，这样就模拟了缺氧状态。CoCl2的作用机理与低氧一致，相当于细胞氧感受器受到低氧刺激，本实验采用CoCl2成功模拟了内皮细胞的缺氧环境〔1-2〕。

表1 MTT法测定各组牛视网膜血管内皮细胞的活性［D（492 nm），±s］

表1 MTT法测定各组牛视网膜血管内皮细胞的活性［D（492 nm），±s］

注：与缺氧组比较，①P＜0.05（方差分析，LSD 法）。 EGB：银杏叶提取物

不同培养时间的光密度值24 h 48 h空白对照组 0.225±0.01① 0.257±0.01①缺氧组 0.193±0.01 0.184±0.01 EGB 低浓度组 0.001 0.214±0.02① 0.260±0.01①EGB 中浓度组 0.01 0.224±0.01① 0.283±0.02①EGB 高浓度组 0.1 0.230±0.02① 0.248±0.01①F值 61.79 29.22 P值 0.000 0.000组别 EGB质量浓度/（μg/ml）

国内外学者自20世纪60年代开始对银杏叶的化学成分、药理作用及临床应用做了大量的研究工作。研究表明，银杏叶提取物中含有的内酯成分能明显地扩张血管，尤其是扩张微循环〔3〕。一项对正常受试者的对比研究发现，口服银杏叶提取物可使眼动脉血流量增加 24%〔4〕。Kristinsson 等[5]的研究也发现，银杏叶提取物可增加视网膜和脉络膜的血液供应，并改善视功能。季梅等〔6〕研究证明银杏黄酮具有抗氧化作用，通过保护血管内皮细胞，促进血管内皮细胞松弛因子的释放而调节血管舒缩功能，扩张血管，增加缺血区血流量，从而改善视网膜末梢循环，以利阻塞血管再通〔7〕。因此目前银杏叶提取物在眼科主要用于眼部缺血性疾病如视网膜静脉阻塞、缺血性视神经病变、糖尿病视网膜病变等。

本实验发现，24 h及48 h缺氧组的光密度值均低于细胞对照组，3个浓度银杏叶提取物组光密度值均高于缺氧组（P<0.05），并且在一定浓度范围内，随着药物浓度的增加而增加，说明银杏叶提取物对缺氧状态下视网膜血管内皮细胞存在剂量-效应关系，适宜浓度的银杏叶提取物对缺氧状态下的RVECs增殖呈明显促进作用。

目前发现RVECs及神经节细胞耗氧量大，对缺血缺氧最敏感，如在糖尿病视网膜病变早期，RVECs及神经节细胞超微结构和分泌功能就发生改变，促使视网膜血管基底膜增厚、血管内外氧交换障碍，使视网膜内血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）增加，破坏血－视网膜屏障，诱导视网膜新生血管形成。有类似发病机制的眼病很多，其他如视网膜静脉阻塞、黄斑变性、高度近视视网膜病变等。本研究提示银杏叶提取物对RVECs有保护作用，也许在一定程度上能阻断RVECs受损这一始动环节，从而减轻血－视网膜屏障的破坏，保持血管舒展和紧缩调节的活性物质的平衡，为治疗这类疾病提供一个新的途径。至于EGB对视网膜血管内皮细胞发挥保护作用的具体机理，尚有待进一步地研究。

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