新生儿蛛网膜下腔出血时检测红细胞胞浆游离钙的临床意义

张小妮，关晓霞，周秀芳

(1.兰州市第一人民医院儿科，2.兰州市七里河区妇幼保健站，3.兰州市妇幼保健院新生儿科，兰州 730000)

新生儿蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)发病率占新生儿颅内出血第一位，是新生儿死亡和存活者不良预后的最常见原因之一［1］。为进一步探讨其发病机制，本研究动态观察SAH患儿体内红细胞胞浆游离钙(RBC［Ca2+］i)水平的变化，探讨其在SAH发病中的作用，为临床治疗SAH患儿提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2006年6月—2010年12月本院和兰州市妇幼保健院住院的经头颅CT扫描证实SAH患儿38例，男34例，女4例;单纯SAH患儿26例，合并新生儿颅内出血(intracranial hemorrhage，HIE)者12例;胎龄(36.9 ±3.9)周，出生体质量(2 080±750)g。选择同期出生的健康新生儿20例为对照组，男14例，女6例，出生体质量(3 363±292)g，平均胎龄(39.1 ±1.6)周，平均入院日龄(11.7 ±7.6)h。各组胎龄、出生体质量、Apgar评分等资料统计无差异性(P＞0.05)(见表1)。除外遗传代谢病、糖尿病母亲婴儿，或母亲有妊娠期高血压疾病、甲状旁腺功能异常及有严重心、肺、肾脏疾病的患儿。

1.2 常规治疗方法 SAH患儿于生后给予保暖、吸氧、纠正酸中毒、维持血气、血糖、血压正常范围及水、电解质平衡，使用鲁米那钠5～7 d等常规治疗。

1.3 RBC［Ca2+］i水平测定 应用 Fura-2/AM法［2，3］。SAH 患儿于生后2 ～3 d、5 ～7 d 及 10 ～14 d后采静脉血2 ml，肝素抗凝，将新鲜抗凝全血在室温下离心震荡5 min，弃上层血浆及白细胞层，吸出沉积红细胞，用PBS缓冲液A稀释，并调整细胞含量为1011/L，从中等量吸出两份红细胞悬液，一份(A管)用1μΜ浓度Fura-2/AM于37℃下保温90 min，另一份(B管)不加Fura-2/AM，但同样于37℃下保温90 min。尔后用PBS缓冲液B稀释10倍，即在荧光分光光度仪上分析测定(Exλ1:335 nm，Exλ2:385 nm，Emλ:515 nm，Ex和 Em光路带宽分别为 5 nm和10 nm;F335是在335 nm激发波长处产生的荧光，F385是在385 nm激发波长处产生的荧光，F335/F385反映胞浆Ca2+浓度的高低)，取值方法采用连续扫描30s之激发光谱积分值，反映红细胞胞浆游离钙浓度的计算式为:RBC［Ca2+］i(F335/F385)=A管F335–B管F335/A管F385–B管F385。对照组以同样时段采集静脉血，标本处理同上。并登记、编号。

1.4 统计学方法 应用SPSS 11.0软件进行处理，计量数据采用均数±标准差(±s)表示，组间比较用方差分析;相关性分析应用直线相关分式计算关联系数r值。以P＜0.05判定差异有统计学意义。

表1 一般临床资料(±s)

表1 一般临床资料(±s)

组别 n 男/女 胎龄(周) 出生体质量(g) Apgar(1 min) Apgar(5 min) 平均入院日龄(h)单纯SAH组26 24/2 37.1 ±3.8 2 860 ±770 4 ±1 6 ±1 10.4 ±7.6 SAH+HIE 组 12 10/2 36.5 ±4.0 2 790 ±780 3 ±2 4 ±1 10.9 ±7.3对照组20 14/6 39.1 ±1.6 3 363 ±292 9 ±1 10 10.7 ±7.8

2 结果

2.1 两组不同时间点 RBC［Ca2+］i水平变化SAH患儿治疗前RBC［Ca2+］i水平显著高于对照组，差异有统计学意义。SAH患儿RBC［Ca2+］i水平于生后5～7 d达到较高水平，然后逐渐恢复，至治疗10～14 d后SAH患儿RBC［Ca2+］i水平与对照组比较仍有统计学意义(见表2)。

表2 两组不同时间点RBC［Ca2+］i水平变化±s)

表2 两组不同时间点RBC［Ca2+］i水平变化±s)

组别 n 生后2～3 d生后5～7 d 生后10～14 d F值 P值SAH组38 2.79 ±0.09 3.46 ±0.04 2.93 ±0.08 10.38 ＜0.05对照组 20 2.15 ±0.18 2.18 ±0.20 2.23 ±0.13 1.84 ＞0.05 t值 7.81 11.03 3.63 P值 ＜0.01 ＜0.001 ＜0.05

2.2 RBC［Ca2+］i水平与新生儿SAH程度的相关分析 以RBC［Ca2+］i水平与单纯SAH组及SAH合并HIE组用Pearson相关性进行分析，结果发现，RBC［Ca2+］i水平与SAH程度存在明显正相关(r=0.631，P ＜0.05)。

3 讨论

新生儿颅内出血是新生儿围生期严重颅脑疾患，常与缺氧缺血性脑病并存。根据出血部位分为硬脑膜下出血、室管膜下-脑室内出血、蛛网膜下腔出血、小脑内出血和脑实质出血。据资料显示［4，5］，ICH占新生儿死亡原因的12% ～19%，而生前误诊率高达65%左右。新生儿SAH是指脑表面血管破裂出血，血液进入蛛网膜下腔，是ICH中发病率最高的一种，文献报道可达77.4%［4］。严重颅内出血，来势凶猛，病情进展快，常表现为:急性颅压增高，脑干功能受累，可在短时间内死亡;脑实质出血，出血后脑积水常易遗留有不同程度的后遗症。因此，颅内出血的预防与准确有效的诊断治疗对降低新生儿的伤残率有重要意义。

Ca2+是独立的第二信使，参与多种细胞功能的调节。Ca2+是细胞膜电生理活动的重要成分，细胞的电活动受电压依赖性钙通道、受体操控性钙通道及钙泵的调节。正常状态下细胞内外钙保持着内低外高的动态平衡。病理状态下，如发生SAH时，脑组织氧供不足，能量代谢发生障碍，ATP大量消耗，导致ATP依赖性酶活性降低。当Na+–K+–ATP酶活性降低时，神经元发生去极化，电压依赖性钙通道被激活，引起Ca2+内流增加［6］，造成细胞内Ca2+超载，导致进入细胞内的 Ca2+不能泵出，同时受Ca2+调节的磷脂酶、蛋白酶、核酸内切酶等被激活，磷脂分解和细胞骨架破坏，细胞产生不可逆损伤。很多研究结果表明Ca2+的失衡是神经元死亡的重要通路之一［7］。

本研究应用Fura-2/AM法测定SAH患儿RBC［Ca2+］i水平，结果显示，SAH患儿治疗前 RBC［Ca2+］i水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P ＜0.01)。RBC［Ca2+］i水平与 SAH 程度存在明显正相关(P ＜0.05)，提示 RBC［Ca2+］i参与了SAH的病理生理过程，在SAH的发病机制中可能起重要作用。SAH合并 HIE患儿病情愈重，RBC［Ca2+］i水平升高愈显著，经过干预治疗，随着患儿病情恢复，患儿体内RBC［Ca2+］i水平逐渐接近正常水平。由此推测SAH合并HIE患儿RBC［Ca2+］i水平持续升高可能预后不良，故临床上可早期动态监测SAH患儿RBC［Ca2+］i水平，以准确诊断及评判其严重程度，及早干预治疗，提高SAH患儿的生存质量。SAH合并HIE患儿RBC［Ca2+］i水平升高，其原因考虑为窒息使患儿机体严重缺氧或缺血缺氧，氧化代谢障碍，ATP合成受到影响，从而使需要ATP供能的细胞膜钙泵等细胞内钙稳态机制不能发挥正常功能，导致RBC［Ca2+］i水平异常升高。RBC［Ca2+］i水平异常升高时，受Ca2+调节的酶如磷脂酶、蛋白酶、核酸酶等将被激活。尤其是磷脂酶A2被激活后引起细胞膜磷脂成分分解;蛋白酶被激活后使膜蛋白、酶蛋白等遭到破坏;核酸酶被激活则引起核酸分解、破坏，最终导致细胞功能紊乱、细胞损害甚至死亡。由于脑神经细胞对缺氧的耐受性较差，在缺氧尤其是缺血缺氧情况下，脑神经细胞较易发生细胞内钙稳态失调，由此引起的脑神经细胞功能紊乱和结构损害，可能是SAH合并HIE患儿救治后遗留神经系统后遗症的原因之一。

因此，RBC［Ca2+］i参与了SAH的病理生理过程，在SAH的发病机制中可能起重要作用，动态监测RBC［Ca2+］i水平可能有助于SAH的早期诊断和预后判断。

［1］Crowley R W，Yeoh H K，Stukenborg G J，et al.Influence of weekend versus weekday hospital admission on mortality following subarachnoid hemorrhage［J］.J Neurosurg，2009，111(1):60.

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［3］张均田，李锡明，石成璋，等.用Fura-2/AM测定细胞内游离钙浓度的方法［J］.中国药学杂志，1991，26(11):655-657.

［4］陈惠金.我国早产儿脑室内出血的早期诊断和防治现状［J］.临床儿科杂志，2004，22(1):3.

［5］Murphy B P，Inder T E，Rooks V，et al.Posthemorrhagic ventricular dilatation in the premature infant:natural history and predictors of outcome［J］.Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed，2002，87(1):37.

［6］王月兰.尼莫地平对缺血性脑损害的保护作用研究［J］.国外医学·麻醉与复苏分册，2001，122(1):51-53.

［7］GrahaMME，Burgoyne R D.Effects of calciuMchannel antagonists on calciuMentry and glutamate release froMcultured rat cerebellar granule cells［J］.J Neurochem，1995，65(6):2117.