猪支原体肺炎活疫苗(168株)肺内免疫机制研究

冯志新，刘茂军，熊祺琰，华利忠，王海燕，甘 源，韦艳娜，苏国东，2，邵国青

(1.江苏省农业科学院兽医研究所·农业部兽用生物制品工程技术重点实验室·国家兽用生物制品工程技术研究中心，南京 210014;2.南京天邦生物科技有限公司，南京211102)

猪支原体肺炎(Mycoplasma pneumonia of swine，MPS)是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)引起的一种接触性慢性呼吸道传染病［1］。本病遍布全球，并且易与其他病原发生混合感染，引起更严重的肺部病变，产生更大的经济损失［2－3］。为控制该病以降低生产成本，提高养殖绩效，目前临床上最为广泛使用的两种办法是药物防治与疫苗免疫。一些药物可有效地抑制猪肺炎支原体的生长，降低肺部损伤，曾对猪支原体肺炎的控制起过重要作用［4］。然而，药物的使用并不能完全清除体内已感染的猪肺炎支原体，从长远考虑并不能达到根治的目的。另外，长期的药物使用所引发的耐药性和抗生素残留已成为猪场保健中存在的一大难题。接种疫苗是控制猪支原体肺炎的另一重要策略。目前，市场上可供选择的疫苗主要为进口灭活疫苗和国产弱毒疫苗。Thacker等［5］研究表明，猪支原体肺炎灭活疫苗免疫后由于不能阻止猪肺炎支原体野毒对支气管纤毛的定植，因此无法产生完全的保护。进一步研究表明，猪体全身的细胞免疫和局部的黏膜免疫机制对抵抗并清除猪肺炎支原体的感染起着关键的作用［6－9］。猪支原体肺炎活疫苗(168株)是当前国内唯一大量推广使用的弱毒疫苗，临床使用效果显著。实验室的攻毒保护试验表明，其保护效率要高于进口灭活疫苗。本试验重点研究猪支原体肺炎活疫苗免疫后产生的机体免疫反应，尤其是猪体细胞免疫和黏膜免疫反应水平，以及疫苗免疫后对猪呼吸道气管纤毛上皮细胞的影响，从免疫机制方面对该活疫苗的免疫效果进行解析。

1 材料与方法

1.1 材料 猪支原体肺炎活疫苗(168株)，批号109039，南京天邦生物科技有限公司;5～10日龄猪肺炎支原体阴性的健康仔猪。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 选取4窝5～10日龄Mhp阴性的健康哺乳仔猪，每窝8～10头仔猪，随机分成两组，每组两窝，随母猪隔离饲养。其中一组每头猪按疫苗说明书要求，肺内注射猪支原体肺炎活疫苗(168株)1头份;另外一组每头肺内注射1 mL PBS缓冲液作对照。于免疫后第0、7、14、21、28天采集鼻拭子分别检测Mhp特异性SIgA抗体和IFN－γ;于相同时间段采集血清，检测Mhp特异性IgG抗体;分别于免疫后第14天和第28天每组随机选取5头猪采集抗凝血3 mL/头，用于淋巴细胞转化检测;于免疫后第28天每组剖杀3头猪，采集支气管上皮组织，用于扫描电镜观察纤毛状态以及通过原位杂交方法检测疫苗株的占位效应。

1.2.2 Mhp特异性SIgA抗体检测 将采集的鼻拭子样品浸液在4℃过夜，第二天在涡旋振荡器上震荡5 s后，尽量吸出鼻拭子浸液，10000 r/min离心5 min，取上清，－20℃保存备用。参照已报道的文献方法［10］检测Mhp特异性SIgA抗体滴度。

1.2.3 Mhp特异性IgG抗体检测 按猪肺炎支原体抗体ELISA检测试剂盒(IDEXX Co，USA)说明书检测血清样品中Mhp特异性IgG抗体滴度。

1.2.4 猪IFN－γ 检测 鼻拭子样品按1.2.2项处理。按羊抗猪IFN－γ ELISA检测试剂盒说明书检测鼻拭子样品中猪IFN－γ滴度。

1.2.5 淋巴细胞转化检测 分别于免疫后第14天和第28天，每头猪无菌采集3 mL抗凝血。参照已报道的文献方法［11］检测特异性淋巴细胞转化，并计算刺激指数SI值。

1.2.6 扫描电镜观察纤毛状态 于免疫后第28天每组剖杀3头猪，取出肺脏，切开支气管，经0.1 mol/L无菌PBS溶液泡洗去除杂质和粘液后剪成约5 mm×5 mm大小块状，剪切时小心不能损伤支气管内表面。将支气管小块用2.5%的磷酸缓冲戊二醛固定液4℃固定过夜;0.1 mol/L PBS清洗3次，每次15 min;乙醇系列脱水后移入丙酮;经醋酸异戊酯替代后，将标本置于二氧化碳临界点干燥仪中干燥;再在真空涂膜仪内喷金，用电子扫描镜(HITACHI，S－3000N，由南京农业大学中心实验室提供)进行观察。

1.2.7 Mhp原位杂交检测 于免疫后第28天每组剖杀3头猪，采集含支气管的肺组织样品，将样品切成0.2 cm×0.2 cm×0.2 cm的小块于10%中性福尔马林溶液中固定。参照已报道的文献方法［12］，对支气管组织中疫苗株进行原位检测。

2 结果

2.1 免疫后呼吸道Mhp特异性SIgA抗体检测分别于免疫后第 0、7、14、21、28 天采集鼻拭子，检测呼吸道中Mhp特异性SIgA抗体滴度，结果如图1所示。试验猪肺内免疫猪支原体肺炎活疫苗后，鼻腔中Mhp特异性SIgA抗体持续上升，至免疫后第21天升至最高，免疫后第28天滴度略微下降;而未免疫对照组的试验猪始终未有Mhp特异性SIgA抗体产生。活疫苗免疫后激活了呼吸道局部的黏膜免疫反应。

图1 猪支原体肺炎活疫苗肺内免疫后呼吸道特异性SIgA滴度检测

2.2 免疫后血清中Mhp特异性IgG抗体检测 分别于免疫后第 0、7、14、21、28天采集血清，检测血液中Mhp特异性IgG抗体滴度。整个试验周期中均未有阳性值检出，说明活疫苗免疫后未能激活机体产生循环抗体。

2.3 免疫后呼吸道IFN－γ检测 分别于免疫后第0、7、14、21、28 天采集鼻拭子，检测呼吸道中IFN －γ浓度，结果如图2所示。试验猪肺内免疫猪支原体肺炎活疫苗后，鼻腔中IFN－γ浓度持续上升，在免疫后14～28 d维持在较高水平;而未免疫对照组的试验猪鼻腔中的IFN－γ浓度始终保持较低水平。活疫苗免疫后，呼吸道局部的细胞免疫也被活化。

2.4 免疫后血液中淋巴细胞转化检测 分别于免疫后第14天与第28天，每头猪无菌采集3 mL抗凝血，分离淋巴细胞后，用猪肺炎支原体全菌蛋白刺激培养，计算免疫组与对照组的刺激指数，如图3所示。免疫组试验猪在免疫后第14天与第28天，血液中淋巴细胞刺激指数分别为1.52与2.01，均与对照组差异明显(P＜0.05)，疫苗免疫后激活了全身细胞免疫反应。

2.5 免疫后支气管纤毛上皮细胞观察 于免疫后第28天每组剖杀3头猪，取支气管上皮组织固定后，用扫描电镜观察上皮纤毛细胞的状态如图4所示。免疫组与未免疫组试验猪的支气管纤毛上皮细胞均细长而整齐。其中免疫组试验猪的支气管纤毛未出现变粗、凝集、脱落等病变，但在纤毛顶端、中部或底部有较多的球状黏附物发现。该实验结果说明，活疫苗免疫对猪的支气管纤毛是安全的。

图4 猪肺炎支原体强毒攻毒后支气管纤毛扫描电镜图

2.6 免疫后支气管上皮细胞上疫苗株的占位检测于免疫后第28天每组剖杀3头猪，取支气管上皮组织固定后，用原位杂交的方法，检测呼吸道上皮细胞表面的疫苗株。如图5所示，免疫组试验猪的支气管上皮细胞表面出现棕色深染信号，而未免疫对照组试验猪的样品中未有相似信号发现。利用原位杂交的方法成功地检测到了活疫苗对支气管上皮细胞的占位效应。

图5 猪肺炎支原体P36探针原位杂交检测图

3 讨论

前期研究［11］对猪支原体肺炎活疫苗免疫后的攻毒保护效果进行了动物试验，同时也检测了相关的免疫学指标。本研究着重对活疫苗免疫后机体所产生的体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫作了系统检测与评价，同时也对疫苗免疫后对猪呼吸道纤毛上皮细胞的安全性进行了评价。在免疫学指标检测方面，本次研究的结果与前期研究数据基本一致。其中，本研究中特异性SIgA滴度在21 d达到最高，随后略有所下降，IFN－γ浓度是上升到14 d后基本保持稳定;而我们的前期研究结果表明，SIgA滴度可一直上升到60 d，IFN－γ浓度可上升至45 d后保持稳定，其中原因可能是本次研究的检测时间只检测到了免疫后第28天，并未对后期进行检测分析。但从免疫后同期的检测数据来看，两次试验结果差异不大，而且总体的分泌趋势是一致的。结果证实，猪支原体肺炎活疫苗免疫后，有效地激活了全身的细胞免疫与局部的黏膜免疫，但体液免疫反应未有检出。另外，南京农业大学也曾用我们的活疫苗菌株配合CpG佐剂通过滴鼻方式免疫试验猪［13］，检测发现支气管表面的黏膜免疫与细胞免疫获得激活。结合我们前期攻毒保护试验的研究数据，再一次验证了猪支原体肺炎活疫苗良好的免疫保护效果与激活猪体的细胞免疫与黏膜免疫反应相关，这与国外关于机体对猪肺炎支原体抗感染的研究结果相符［6－9］。

猪肺炎支原体对猪呼吸道的感染主要通过P97蛋白等黏附因子定植于气管与支气管的纤毛上皮细胞上，并对纤毛细胞产生毒性作用，使纤毛发生破损、脱落，在引起肺部炎症的同时，破坏猪呼吸道的物理屏障，引起一系列的继发感染。对于猪肺炎支原体对纤毛细胞的损伤作用，本研究曾将猪肺炎支原体组织强毒感染的支气管纤毛组织进行了电镜扫描观察，结果发现大量的纤毛发生了变粗、凝聚和脱落现象，证实了上述致病机理。活疫苗免疫研究中，通过支气管纤毛细胞的扫描电镜观察发现，活疫苗免疫猪的纤毛细胞上有球状黏附物，结合原位杂交的试验结果分析，黏附在纤毛上的球状物可能是疫苗菌株;但免疫组与未免疫组的纤毛形态正常，细胞状态无差异，说明疫苗可以在纤毛上黏附，但不会对纤毛细胞产生上述损伤作用。

本研究发现，猪肺炎支原体活疫苗可在免疫猪的呼吸系统纤毛上皮细胞黏附和定殖，并显著提升猪体淋巴细胞刺激指数、IFN－γ和Mhp特异性SIgA抗体水平。由于支原体特有的免疫逃避机理［14］，疫苗株可能在免疫猪的呼吸道表面产生较长时间的占位效应和个体保护，这符合活疫苗(168株)一次免疫而保护期较长的特性。鉴于疫苗菌株的占位效应和支原体空气传播能力［15］，长时间活疫苗免疫将使疫苗株与野毒株对其共同靶细胞及生存环境产生竞争而起到保护作用。

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