T14502C突变位点在Leber遗传性视神经病变发生发展中的作用

田 博 周和政 张绍阳 陈云辉

Leber遗传性视神经病变(Leber hereditary optic neuropathy，LHON)是一种引起患者严重视功能障碍的母系遗传性疾病，由线粒体DNA突变引起并与三个原发性突变位点(G11778A、T14484C、G3460A)密切相关，主要为男性发病。T14502C作为继发性突变位点与G11778A位点同时出现在LHON家系中，国内相关报道罕见，因此本研究就发现的T14502C突变位点家系的临床资料及相关分子生物学特征展开研究。

1 资料与方法

1.1 研究对象 本家系来自于江西省鹰潭市，先证者为一位18岁男性患者，以“双眼视力逐渐下降8 a”为主诉就诊，8 a前，该患者无明显诱因出现右眼雾视，辨色困难，之后1周，上述症状逐渐加重，且左眼也出现相同症状，发病过程中无眼痛、头痛、恶心、呕吐等其他不适。眼科检查:双眼视力均为数指/眼前且不能矫正，眼压:右眼17 mmHg(1 kPa=7.5 mmHg)，左眼15 mmHg，眼前节检查未见明显异常。直接检眼镜检查可见:双眼视盘苍白，C/D为0.5～0.6，盘周血管数量少，视网膜血管略细，黄斑区中心反光可见。双眼视野(Carl Zeiss Meditec HFAⅡ，Central 30-2 Threshold Test)均表现为大片盲区，仅存10°左右视岛。了解患者家族史可知其连续三代16位家族成员中3人患病，1人为高度可疑患者但已故(因亲属代述其症状与家系患病高度相似，且先证者与其同父同母)，均为男性，因此对先证者拟诊为LHON并对此家系15位成员进行了基因检测及眼科相关检查，家系图见图1。

Figure 1 Pedigree structure of this family with LHON.Patients were indicated by filled squares symbols，and normal subjects were shown with empty symbols.Arrow indicated the proband LHON家系图。图中患病者为实心标记，表型正常者为空心标记，箭头所指为先证者

1.2 线粒体DNA突变检测方法 在15例家系成员知情同意的前提下，抽取每位成员外周静脉血2 mL，密度梯度离心法分离和纯化外周血单个核细胞，改进高盐法提取细胞mtDNA，根据三个原发性突变位点(G3460A、G11778A、T14484C)的碱基座位，设计引物并进行PCR扩增，将扩增产物切胶纯化后由上海生工生物工程有限公司进行双向碱基序列检测。

2 结果

2.1 突变位点检测结果 15例家系成员中均未发现携带G3460A和T14484C两个突变位点，10例母系成员同时携带有G11778A和T14502C两个突变位点，其中的 3例为 LHON患者。G11778A和T14502C两个突变位点的野生型及突变型DNA测序图分别见图2-图5。

Figure 2 Identification of G11778A mutation(mutant).Figure 3 Identification of G11778A mutation(wild-type).Figure 4 Identification of T14502cmutation(mutant).Figure 5 Identification of T14502cmutation(wild-type) 图2 G11778A位点DNA测序图(突变型)。图3 G11778A位点DNA测序图(野生型)。图4 T14502C位点DNA测序图(突变型)。图5 T14502C位点DNA测序图(野生型)

2.2 眼科检查结果 家系中的3例患者均为男性，发病年龄为10～17岁，平均13岁，患眼视力均≤0.01且不能矫正，除先证者双眼发生视力下降时间相隔1周外，其余两位患者双眼同时渐进性视力下降，且仅先证者出现色觉障碍。3位患者双眼眼底荧光素血管造影检查显示:双眼视盘盘面毛细血管始终未见荧光充盈，晚期仅见盘沿荧光着色。无荧光遮蔽，视网膜血管无渗漏。通过了解病史得知患者均未进行神经营养及血管扩张药物治疗。3例患者临床信息见表1。

表1 3例发病者的临床信息总结Table1 Summary of clinical data for 3 affected individuals

3 讨论

目前为止发现的LHON均为母系遗传，易于累及青壮年男性，第一个与之相关的线粒体DNA突变位点G11778A在1988年由Wallace等［1］首先报道。随后G3460A和T14484C位点相继被发现［2-3］，此三个主要的原发性突变位点位于编码呼吸链复合物Ⅰ的基因序列中，与临床上95%的LHON病例密切相关，而在中国LHON患者中，又以G11778A突变位点为主(90.9%)，相比之下，G3460A及T14484C突变位点在我国LHON患病人群中所占比例较低［4-6］。但即使如此，携带同一个位点G11778A的中国家系，其各自的外显率、性别比例、成员发病及预后情况也不尽相同［7-8］。因此，对于寻找其他可能导致LHON外显率差异、显著性别偏倚、相同位点但不同视力损害程度的因素成为这一领域的研究热点，包括继发性突变位点、线粒体基因组遗传异质性、线粒体单倍体型、核基因背景、生活习惯和环境因素等。Johns等［3］对英国8个携带G11778A突变的LHON家系进行调查发现，患病者自身携带的突变线粒体基因组比例高达96%，而在一些未发病携带者这一比例不足80%。而国内有研究表明，携带G11778A突变的中国家系之间的线粒体基因组异质性差异对发病率及视力无明显影响［7］。因此，继发性突变位点对LHON发病以及预后的影响成为我们关注的因素。

在此研究中，我们对一个LHON中国汉族家系成员进行了眼科检查、线粒体基因位点检测，发现该家系患病成员共同特点是以严重的视力损害为主，未发现合并其他眼科疾病以及耳聋、共济失调等神经系统疾病。家系中携带者的突变位点为G11778A及T14502C，除先证者双眼发生视力下降时间相隔1周外，其余两位患者均双眼同时渐进性视力下降，不伴眼痛等其他不适，且迄今为止3例患者均未出现视力恢复情况，这一情况与国外对携带G11778A位点家系报道情况相一致，即患者视力损害最严重，恢复或好转者罕见，预后差［9］。3例患者眼底荧光血管造影并未表现为病程早期典型的视神经盘周围的浅层毛细血管扩张，视网膜血管迂曲扩张等［10］，推测可能与病程较长视神经已萎缩有关。

Zhang等［11］对同时携带 T14484C和 T14502C的一个四代中国家系研究后发现:患者发病较早，9位患者年龄均介于16～18岁之间，且所有母系家族成员均呈现典型的LHON临床特征，外显率达100%。而相比之下，单独携带T14484C突变位点的3个中国家系外显率却只有27% ～60%［12］。提示T14484C突变本身并不足以导致家系内所有携带者发病，在发病过程中T14502C突变起到协同作用。王燕等［5］报道110例中国人G11778A突变患者中17.6%视力低于0.01，52.1%发病视力介于0.01与0.10之间，30.3%视力高于0.10，最终6.8%患者视力有所恢复。但本研究家系中所有患者视力均低于0.01，且迄今为止未见任何视功能恢复情况。发病年龄方面，平均发病年龄13岁，虽例数较少，但可观察到本家系患者发病年龄均未达18岁，明显比单独携带G11778A位点的中国家系的发病年龄19.3岁低［13］。T14502C与 T14484C碱基突变位点同位于ND6基因，因此相比较之下，如果突变位点的空间距离能够削减其协同作用，即使T14502C与位于ND4基因的G11778A位点的协同作用稍弱，根据上述分析，这种作用仍可能存在。Zhang等［14］研究认为，T14502C突变能够增加LHON中国家系的外显率，但与文献报道的G11778A家系外显率33%～60%［9，15］相比，并未观察到本家系外显率显著升高(33%)，且本家系中患病者均为男性，性别偏倚更为突出。

ND6基因编码产物参与组成质子迁移模块，目前认为ND6基因参与呼吸链复合物Ⅰ早期装配过程，对于呼吸链复合物Ⅰ的膜壁装配以及结构的维持不可或缺［16］，ND4基因参与之后的大量中间亚单位装配后的过程［17］。因此ND6与ND4基因对于呼吸链复合物Ⅰ的正确装配均具有十分重要的意义。T14502C突变引起ND6基因编码产物中缬氨酸代替了异亮氨酸，其在种属进化中并不保守。Chalmers等［13］认为，线粒体继发性点突变可能只是基因组的单核苷酸多态性，并不对疾病本身产生影响。但综合以上研究结果分析可知此突变仍可能影响了LHON的性别比例及临床预后等方面。本家系调查局限性在于因家系成员配合原因，更多的旁系成员无法统一接受调查研究，因此此次调查对象数量有限。据患者Ⅲ1描述，其家族远亲也同样存在相同症状患者，进一步的研究应扩大家系范围，同时各成员生活习惯及环境因素是否参与发病，值得我们进一步探讨。

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